PI3K/Akt/mTOR信号通路在卵巢功能减退发病机制中的作用

PI3K/Akt/mTOR信号通路在卵巢功能减退发病机制中的作用

万云慧，陈晓勇*

江西省妇幼保健院中医科/江西省中西医结合女性生殖重点研究室，江西省南昌市330006

[摘要]目的 探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路在卵巢储备功能减退中的作用机制。 方法 选取15只SD雌性大鼠，随机分为3组，每组各5只，任取1组为正常组，剩余2组构建卵巢储备功能减退大鼠模型，分别为模型组与雷帕霉素组。ELISA法测定大鼠血清中雌二醇（estradiol，E2）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）水平；计算卵巢指数；RT-qPCR法检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关mRNA表达。结果 与正常组相比，模型组大鼠血清E2、AMH水平下降，FSH、LH水平上升，卵巢指数降低，PI3K、AKT、mTOR、Beclin-1、LC3I/LC3II、P62的mRNA表达增加（P＜0.05）；与模型组相比，雷帕霉素组大鼠血清E2、AMH水平上升，FSH、LH水平下降，卵巢指数增加，雷帕霉素组PI3K、AKT、mTOR、Beclin-1、LC3I/LC3II、P62的mRNA表达降低（P＜0.05）。 结论 抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能够改善卵巢储备功能减退大鼠激素水平，提高其卵巢指数，这为临床卵巢储备功能减退的治疗提供了新思路。

[关键词]PI3K/Akt/mTOR信号通路；卵巢储备功能减退；发病机制

卵巢储备功能减退指卵巢产生卵子的能力减弱，且卵母细胞质量较差，生育能力也下降[1]。卵巢储备功能减退患者多在40岁以下，临床表现为性激素缺乏，月经稀发、闭经等，随着病情进一步发展，患者会出现卵巢早衰，这会引发心理及生理功能障碍，严重影响家庭的和谐稳定[2]。近年来，卵巢储备功能减退的发病呈现增加趋势，因此成为临床研究的热点。遗传、免疫、酶缺乏、心理、环境、手术等因素均会引起卵巢储备功能减退的发生，此外，卵巢颗粒细胞的自噬与凋亡可引起卵泡闭锁、停止发育[3]。相关研究指出[4]，卵母细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路可以调控原始卵泡的静止与活化，PI3K/Akt/mTOR信号通路可抑制卵泡细胞过度激活，避免卵巢储备功能减退的发生，但该通路在卵巢储备功能减退中的具体作用机制不清楚。本研究旨在构建卵巢储备功能减退大鼠模型，检测大鼠血清激素水平、卵巢指数、PI3K/Akt/mTOR信号通路相关mRNA表达，以期阐明PI3K/Akt/mTOR通路在卵巢储备功能减退发病中的作用机制，为卵巢储备功能减退的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及饲养

清洁级成年SD雌性大鼠，鼠龄12周，体质量（230±10）g，采用笼养方式饲养。标准光照，饲料喂养，自由摄食，室温20℃～25℃，相对湿度45％～55％。适应性喂养1周后，行阴道脱落细胞涂片检查，每日1次，连续10d，筛选出动情周期为4~5d的大鼠15只。

1.2动物分组

将15只大鼠随机分为3组，各5只，任取1组为正常组，剩余2组构建卵巢储备功能减退大鼠模型，分别为模型组与雷帕霉素组。

1.3模型构建

正常组大鼠予0.9％生理盐水1ml腹腔注射一次，每日定时取阴道分泌物涂片观察动情周期。模型组、雷帕霉素组大鼠参照文献[5]予以CTX 75mg/kg腹腔单次注射。造模后，大鼠出现精神差、蜷卧少动、脱毛、易激惹等表现，提示造模成功。

1.4大鼠饲养及给药

大鼠均标准饲料饲养，自由摄水，CTX注射2小时后开始灌胃给药。正常组给予2ml生理盐水灌胃，1次/d；模型组给予2ml生理盐水灌胃，1次/d；雷帕霉素组给予雷帕霉素1mg/kg 灌胃，1次/d，均连续灌胃28天。

1.5检测指标

1.5.1 ELISA法检测血清激素水平

给药结束后于大鼠耳静脉取血，血液静置30min，3000r/min离心5min，分离血清，血清置于-20℃保存待测。按照ELISA试剂盒说明书测定大鼠血清中雌二醇（estradiol，E2）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）的水平。

1.5.2计算卵巢指数

给药结束后，断头处死大鼠，完整取出大鼠卵巢，去掉筋膜及脂肪组织，电子天平称重，记录卵巢湿重，计算卵巢指数，卵巢指数=卵巢湿重（mg）/体重（g）×100%。

1.5.3 RT-qPCR法检测PI3K/Akt/mTOR通路mRNA表达

取一侧卵巢，解剖镜下除去卵巢周围组织及膜后，置于无菌培养皿中，用1ml注射器针头刺破卵泡，使颗粒细胞充分释放于培养液中，而弃卵巢，收集含颗粒细胞的培养液于15 ml 离心管中，离心（800r /min，8min），弃上清，吸取颗粒细胞层，收集颗粒细胞，对卵巢颗粒细胞进行分离，Trizol试剂盒提取总RNA，凝胶电泳，检测、计算总RNA，逆转录cDNA。PCR扩增程序：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s（35 个循环）；72 ℃10 min。按2－ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，实验重复3次。

1.6统计学分析

实验数据采用SPSS21.0统计分析软件进行处理，符合正态分布且方差齐的计量资料用均数±标准差表示，多组间采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠血清E2、FSH、LH、AMH水平：与正常组相比，模型组大鼠血清E2、AMH水平下降，FSH、LH水平上升（P＜0.05）；与模型组相比，雷帕霉素组大鼠血清E2、AMH水平上升，FSH、LH水平下降（P＜0.05），见表1。

表1各组大鼠血清E2、FSH、LH、AMH水平（x±s，n=5）

2.2各组大鼠卵巢指数：与正常组相比，模型组大鼠卵巢指数降低（P＜0.05）；与模型组相比，雷帕霉素组大鼠卵巢指数增加（P＜0.05），见表2。

表2各组大鼠卵巢指数（x±s，n=5）

2.3各组大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路mRNA表达：与正常组相比，模型组PI3K、AKT、mTOR、Beclin-1、LC3I/LC3II、P62的mRNA表达增加（P＜0.05）；与模型组相比，雷帕霉素组PI3K、AKT、mTOR、Beclin-1、LC3I/LC3II、P62的mRNA表达降低（P＜0.05），见表3。

表3各组大鼠PI3K/Akt/mTOR通路mRNA表达（x±s，n=3）

3讨论

卵巢储备是指卵巢皮质区卵泡生长、发育、形成可受精的卵母细胞的能力，能够反映女性的生育潜能。卵巢储备功能低下则指卵巢储备功能发生异常的消耗，导致卵巢功能过早的衰竭，造成生育能力下降。研究指出[6]，卵巢储备功能低下的发病率约为10%，并且呈现递增趋势，若卵巢储备功能低下患者未及时就诊并进行干预治疗，随着病情加重，将会进展成卵巢早衰，出现未老先衰症状，给患者造成心理和生理的双重压力。卵巢储备功能低下的发病机制复杂，约有50%~70%的卵巢储备功能低下患者发病原因不明。因此，有必要探索卵巢储备功能低下的发病机制，为其临床治疗提供理论依据。卵巢储备功能低下的发生发展可能与遗传因素、酶缺乏、促性腺激素及其受体异常、自身免疫损伤、特发性、卵巢破坏性因素（放疗、化疗、手术、感染等）、卵细胞储备减少或耗竭过多等有关。PI3K/Akt/mTOR通路主要由PI3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase serine threoninekinase，PI3K）、蛋白激酶B（proteinkinase B，PKB，Akt）和哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）3个作用分子组成，在正常细胞生理、癌症扩散、肿瘤发生和转移中都发挥作用。研究发现[7]，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1的活性增强可以激活整个原始卵泡池，使卵泡更早地发育成熟，在成年早期就出现了卵泡耗尽和卵巢早衰。卵巢功能衰退后，E2水平的下降促使PI3K/Akt/mTOR信号通路的下调，从而导致卵巢变小，子宫萎缩。此外，mTOR的激活可以刺激青春期雌性大鼠LH的分泌，使用mTOR抑制剂后，能延迟阴道的开张，降低LH和E2的水平，并导致卵巢和子宫的萎缩，因而学者认为PI3K/Akt/mTOR与下丘脑-垂体-性腺轴相关。但PI3K/Akt/mTOR信号通路在卵巢储备功能低下中的具体作用机制不清楚，本研究拟复制卵巢储备功能低下大鼠模型，探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路在卵巢储备功能低下发病中的作用机制。

本研究筛选出动情周期为4~5d，动情期1~2d，连续出现规律动情周期的15只雌性大鼠为实验大鼠，然后通过腹腔注射CTX构建卵巢储备功能低下大鼠模型从而进行实验研究。FSH与LH是作用于卵巢皮层的促性腺激素，能够调节卵巢功能。卵巢功能减退，FSH、LH水平则增加，卵泡与雌激素随之减少，卵泡和卵子的生长发育因此被抑制。AMH可通过抑制颗粒细胞芳香化酶活性、减少LH受体数目等途径调节卵泡生长发育。血清AMH水平下降与卵巢储备降低密切相关，低水平AMH及其在特定时期迅速下降的特征是卵巢储备功能不足的标志。观察大鼠血清E2、FSH、LH、AMH水平发现，模型组大鼠血清E2、AMH水平下降，FSH、LH水平上升，经雷帕霉素干预后，血清E2、AMH水平显著上升，FSH、LH水平显著降低，这表明雷帕霉素可以改善卵巢储备功能低下大鼠的激素水平，本研究还发现，雷帕霉素可以增加卵巢指数，提示其能够改善卵子质量，提高卵巢功能。

为探索PI3K/Akt/mTOR信号通路在卵巢储备功能低下中的作用，本研究还进行了mRNA水平检测，结果表明，雷帕霉素组PI3K、AKT、mTOR、Beclin-1、LC3I、LC3II、P62的mRNA表达降低，这表明使用雷帕霉素后能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，下调了Beclin 1和LC3II/LC3I水平，抑制自噬情况，减少p62消耗，这为临床卵巢储备功能低下的治疗及卵泡发育提供实验依据，具有重要的临床意义。但文章也存在局限，本研究仅在大鼠体内进行研究，用于人体还需更深入探索，另外，是否有其他信号通路与其相关尚不明确，也需深入研究。

参考文献

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[3]沈开元,杨冠群,罗平,等.卵巢储备功能减退患者卵泡液外泌体对小鼠卵母细胞体外成熟的影响[J].生殖医学杂志,2022,31(10):1422-1429.

[4]佟雪,梁潇,宿滋,等.基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研究补肾法对体外培养小鼠卵母细胞成熟的促进作用[J].北京中医药大学学报,2021,44(06):510-518.

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[6]顾雨婷,梁程程,沈聪,高晓晴.知柏地黄丸治疗卵巢储备功能低下不孕疗效研究[J].陕西中医,2022,43(10):1376-1379.

[7]宋文广,付浩,郭敏,等.原发性卵巢功能不全患者原始卵泡体外激活技术[J].国际生殖健康/计划生育杂志,2021,40(06):486-489.

通讯作者简介：陈晓勇，（1967-），男，硕士，研究方向：妇科生殖内分泌。

课题基金：江西省卫生健康委科技计划项目（编号：20203581）；江西省自然科学基金资助项目(编号: 20202BABL216075) ；江西省中医药管理局科技计划项目（编号：2020B0329）