调节性T细胞在肿瘤免疫微环境中的作用及研究进展

调节性T细胞在肿瘤免疫微环境中的作用及研究进展

何欣彤

上海市市北中学, 上海  200070

摘要：

调节性T细胞 (Regulatory T cells. Tregs)作为T淋巴细胞的一种，通常在免疫反应中具有负面调控的作用。通过抑制来自不同细胞的免疫反应，调节性T细胞的功能不容小视，它可以维持免疫平衡，同时也能使机体对相关免疫反应更耐受。Tregs大量浸润肿瘤微环境 (tumor microenvironment TME)，既可通过分泌抑制性细胞因子来抑制肿瘤免疫又可促进肿瘤的发生、发展及转移。近年来Treg被广泛用于抗肿瘤药物的研发及临床疗效评价等领域，己成为肿瘤免疫学研究热点之一。目前，国内外已有多种针对Tregs的单克隆抗体进入临床试验阶段。它根据起源的不同可以分为天然型Treg和外周诱导型Treg。结果发现,Treg细胞是肿瘤微环境中的一个重要成分，其在肿瘤免疫逃逸及靶向治疗过程中均具有十分重要的地位。Treg靶向治疗对于发展衍生的肿瘤免疫治疗方法有着至关重要的参考价值。故本文就与肿瘤有关的Treg细胞起源，功能，如何参与肿瘤发生发展及CAR-T细胞亚群的治疗等方面研究进展作一概述。

关键词：肿瘤；调节性T细胞；免疫治疗；Foxp3；白介素10

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近些年来，伴随着社会的进步与技术的进步，健康问题己经成为人们普遍关注的重点问题。综观目前，恶性肿瘤在现今仍然是一种很难根除的病症，所以寻求新的更为有效的治疗策略已刻不容缓。肿瘤微环境为肿瘤发生发展提供了土壤[2]，而肿瘤发生和转移与其微环境密切相关。调节性T细胞（Treg）作为一种重要的免疫细胞，起着免疫抑制和调节免疫反应强度的作用。Treg在正常体中以主动调节方式始终存在着对T细胞激活和增殖的潜在自身反应，并使之处于动态平衡之中，以达到有效地控制病情的目的。近年来研究阐明Tregs对多种免疫性疾病有影响，它在多种免疫疾病中通过主动调节，激活和增殖始终存在的正常机体内可能发生自身反应的T细胞，并使之处于动态平衡状态，以达到有效地控制病情，目的。例如肌萎缩性脊柱侧索硬化症、系统性红斑狼疮等。另外，Treg细胞最近被公认为是肿瘤靶向治疗的重要角色。另外，近年来研究显示Treg细胞对妊娠及井发症起着至关重要的作用，Treg细胞的数量或功能异常与其不孕、流产、子痫前期和其他妊娠并发症有一定的相关性[3]。而且，最近研究显示，Tregs是CD4+T Cells中的一个重要亚类群，其与Thelper 17 cells (Th17） 之间相互影响、拮抗，同时具有可塑性，肠道微生态调控能够影响二者分化和平衡并介导结直肠癌发生和发展[4]。这些研究结果使Tregs有希望成为肿瘤治疗新靶点和癌症患者潜在治疗策略，在肿瘤的靶向治疗方面起着举足轻重的作用。

1.Treg的特征

1.1 Treg的起源及表型

Tregs在胸腺、骨髓、淋巴结和外周血中生成，通过CCL22与其受体结合后迁移到肿瘤微环境中[1]，然后通过IL-2和TGF-β联合诱导最初CD4+、CD25-向CD4+和CD25+T细胞转化为Foxp3表达。在TGF-β的存在与作用下，Treg细胞可直接从胸腺和Foxp3+T细胞分化出来，表达Foxp3、CD25＋、CD4＋、CD3＋、CD127low等表型特征。它依据Treg的表达与否以及有无抑制功能可以分为稳定型Treg、脆弱型Treg和不稳定Treg三种类型。 稳定型Treg在终端分化和抑制功能较强的Foxp3中有表达。脆弱型Treg在Foxp3中的表达量较高，而IL-10和其他抑制因子的表达量降低，抑制功能减弱，刺激后Foxp3的表达量升高。失稳的Treg不能表达Foxp3且没有抑制功能。

1.2 Treg的分类

    Treg按其起源分为天然型（Natural Treg, nTreg）及外周诱导性（Inducible Treg, iTreg）2个亚型。Treg细胞发育于新生儿胸腺内，随后进入外周组织，并通过细胞接触机制产生抑制功能从而调控机体的免疫应答。它以CD4+、CD25+和Foxp3+高度表达，而CD127无表达或表达较弱为主要特点。它在机体内的功能主要是对自身反应性T细胞（TCR/CD28）产生抑制作用，并通过TCR/CD2激发及IL-2达到体外扩增从而对外周血、淋巴器官、炎症部位及肿瘤组织等产生免疫调节作用。iTreg细胞是经初始T诱导生成、受特异性抗原刺激、受免疫抑制细胞因子如TGF-β、IL-2、IL-10、IFN-γ、IFN-α诱导分化而成。 它由Tr1（CD4+、CD25low、CD45RBlow）、Th3（CD4+、CD25low）几个亚型组成，驱动IL-10、TGF-β及其他抑制因子分泌，介导免疫抑制信号通路进而发挥免疫抑制作用

[5]。它在体内的作用是以黏膜免疫及炎症反应为主，并在体外经CD3和IL-10扩增。

1.3 Treg的免疫作用

   近年来研究显示, Treg细胞与不同种类的免疫细胞亚群接触后，会通过产生抑制性的细胞因子来降低机体的免疫反应。通过免疫抑制反应以及Treg细胞自身形成的对抗原的耐受，进一步避免自体免疫过盛而引起的疾病。无独有偶，肿瘤细胞也利用Treg细胞这一特性进行免疫逃逸，从降低免疫作用到对抗原的不敏感，肿瘤可以一步一步的规避来自人体免疫的伤害。因此Treg细胞也同时被视为肿瘤进一步发展生长中所不可或缺的免疫细胞。但是,Treg细胞是否真的能有效地发挥作用却一直是一个悬而未决的问题，尤其是人类免疫系统具有高度复杂性，且与许多其他系统存在复杂而密切的关系。免疫系统作为人类身体内重要的防御机制，可以在病原体进入身体时立刻反应并清除，也可以在自体细胞达到一定衰老程度或发生不可逆的损伤时进行清除。调节性的免疫细胞通过平衡和调节过度的免疫反应，从而降低可能产生的人体组织的损伤或机体的死亡[6]。多数研究均显示Treg细胞缺失可直接引起炎症疾病，因此Treg细胞对维持机体平衡具有重要影响。

2. Tregs在肿瘤中的作用

2.1 Tregs作用于肿瘤微环境

2.1.1 Tregs和TME

    肿瘤微环境是肿瘤发生、发展赖以存在的土壤，其发生、转移与其微环境关系密切。它主要是由肿瘤细胞、免疫细胞、炎症细胞以及多种细胞因子和趋化因子组成。肿瘤微环境可分为：①中性粒细胞；②巨噬细胞；③淋巴细胞；④单核细胞。其中以中性粒细胞为主.它具有缺氧、酸性和炎症等特性。肿瘤微环境非但没有起到抗肿瘤效应的作用，反而会促进肿瘤生长。肿瘤微环境由肿瘤细胞及其周围组织，免疫细胞共同作用所构成的复杂综合体系。它对维持正常人体稳态具有重要意义。同时也能导致机体免疫监视功能紊乱以及多种疾病的出现。近年来，随着分子生物学技术的不断提高,DNA甲基化已成为一种不可或缺的表观遗传学修饰方式。它的存在促进了肿瘤细胞的增殖、迁移能力和免疫逃逸，从而推动了肿瘤发生和发展。研究显示浸润进入微环境的Tregs参与肿瘤免疫逃逸时,Tregs分泌TGF-β, IL-10,IL-35下调抗肿瘤免疫并抑制DC抗原呈递, CD4+辅助T细胞功能及生成肿瘤特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞。研究显示表达TNFRSF家族基因Treg细胞可以帮助肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤的发生发展[6,7]。Treg细胞所表达的CCR8，与许多癌症的不良预后有关[8、9]。 CCR8增强Treg细胞抑制功能和阻断CCR8信号有可能帮助消除CTLA-4抑制功能和抑制肿瘤生长[1]。其中，氧自由基在此过程中扮演了重要角色。近年来越来越多证据表明：氧自由基对肿瘤血管内皮细胞具有毒性作用，并通过直接或间接影响信号传导通路引起多种疾病。 结果发现Foxp3通过抑制糖酵解及myc基因的表达、强化OXPHOS、线粒体内膜呼吸链复合物、促进Treg细胞分解及NADH氧化等作用[12]。Foxp3的缺失引起mTOR2信号的转导失调和有氧代谢的加强[1]。 

    Tregs对TME有极为显著的影响, Tregs可以调节肿瘤微环境内的其它细胞，并通过细胞因子进一步产生调节作用。研究结果表明，Tregs的淋巴细胞活化基因3可以结合DCs主要组织相容性复合II（MHC2）类分子，从而调控DCs，使其不能成熟，而未成熟的DCs不具有抗原递呈功能，因此会削弱肿瘤微环境中效应性淋巴细胞的激活以及降低抗肿瘤抗原的递呈反应[6]。同时,Tregs还具有增强CD4+/CD8+。因此Tregs能够作为一种有效的免疫调节因子对免疫应答起到调节作用。另外，它也是一个潜在的治疗靶点。Treg可以利用神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1）对CD8+T细胞的抑制反应，从而降低DCs激活的CD8+T细胞数量，降低人体内的抗肿瘤功能[7]。

2.1.2 Tregs与B细胞

   已有研究显示，Treg直接暴露于GCB细胞可能对体液反应调控具有促进作用，本论文研究者通过活体多光子显微镜观察到Foxp3+T细胞与B1-8hi B细胞间的确存在显着的可探测相互作用，并将其划分为两个不同模式：Foxp3+T细胞在某一B细胞处聚集，B1-8hiB细胞后拖曳一Foxp3+T细胞，此种细胞虽然作用时间一般较B细胞及辅助T细胞短，但是偶而作用时间较B细胞长达十几分钟。 因此，研究者们对B细胞和Foxp3+T细胞（GC）在进化过程的各个时期之间的相互影响作了进一步的探索。 为了进一步探究两者间的作用机制,Burke等人使用多通道荧光探针（MCDF）来观察这两类细胞间的相互作用。他们分别对上述实验过程做了记录。 结果表明前期GC内Foxp3+T细胞只对GC B细胞有有限作用，而终末期GC内上述作用越来越显着，其作用时间及形态类似于TFH-B细胞间作用

[8]。最近研究显示免疫抑制细胞中Treg, Breg细胞分布对多囊卵巢综合征有显着意义。 其不仅参与了胰岛素抵抗、高雄激素血症等生理病理过程，而且也是导致妊娠结局不良及不孕不育症发生发展的原因之一。CD4＋CD25＋CD127low/-Treg细胞对PCOS临床进展及不孕不育发挥着重要作用[9]。

2.1.3 肿瘤微环境中Treg细胞调节的信号分子及通路

   TME对Tregs进行调控的信号通路主要有IL-33-ST2通路、PI3K通路和Hippo通路。研究显示，Treg细胞中的ST2L和IL-33可以结合，从而增加Treg细胞的数量并刺激Treg细胞产生免疫抑制作用[14]。此外,Tregs通过多种信号转导途径参与调控细胞因子分泌、炎症反应和凋亡过程。阻断ST2L-IL-33信号通路的负调节作用受到抑制。ST2表达引起Foxp3＋Treg的激活和迁移有利于肿瘤微环境Treg细胞的聚集。IL-33和Treg表面层ST2复合后活化MyD88导致Foxp3+Treg体内扩增量大[1]。而IL-33-ST2通路能够抑制Th17的分化[1]。

   PI3K-Akt-mTOR信号转导通路具有生长因子敏感性，调控转录及代谢过程[17]并抑制肿瘤细胞凋亡等作用，在肿瘤发生，发展中关系密切[1]。PI3K信号转导通过磷酸化活化或者抑制底物活性来调控细胞增殖、分化、凋亡和迁移的表型。目前,PI3+/PI4已被证实是多种恶性肿瘤的标志物,但不同类型癌症之间是否存在差异还不清楚。当Treg细胞分化时, PI3K的信号被抑制。 它在胰岛素样生长因子（IGFs），氨基酸-营养物质，自噬和肿瘤治疗等方面均具有反应和影响，还需要进一步深入研究。 

   在1995年的果蝇相关研究中，Hippo信号通路（Hippo-Hippo）作为一条高保守生长控制信号通路被科学家发现，其功能多种多样，可以改变器官的体积以及平衡细胞增殖或者细胞的衰老死亡等[20、21]。Hippo通路以激酶级联反应为中心。它通过调节细胞周期、转录因子等对染色体结构和形态产生影响。该途径参与肿瘤的形成。目前已被认为是治疗乳腺癌的一种有效方法之一。但其具体作用机制尚不清楚。最近已有研究证明WWC蛋白家族在MST1/2活化LATS/2中具有重要作用和分子机制，基于该蛋白家族发展出SuperHippo迷你基因能显著地抑制各种肿瘤的发生[10]。

2.2 Tregs自身促进肿瘤

  Tregs可以通过自身分泌的细胞因子直接调控其他存在于在肿瘤微环境内的细胞，其细胞因子还可以间接的改变肿瘤免疫的相关过程。Treg通常会分泌抑制性细胞因子，例如IL-35, IL-10和转化生长因子-B（transforming growth factor-p）等。免疫抑制性的细胞因子可以激活抗凋零分子信号的表达，进而提升肿瘤细胞抗凋亡的能力，削弱免疫效应细胞的诱导功能。TGF-B可以充分的抑制人体的免疫反应，还能“隐藏”肿瘤细胞，使免疫效应细胞的识别功能失效[13, 14]。已有研究发现, TGF-β有抑制NKs细胞毒杀伤的功能，能够帮助肿瘤细胞避免细胞凋亡的命运[14]。DNAX活化蛋白12（DAP12）是一种跨膜受体蛋白，主要存在于NKs,粒细胞和单核/巨噬细胞等多种细胞的表面，对活化信号的传递起着至关重要的作用〔7〕。Treg也可以抑制肿瘤组织内NK活性和白细胞介素1α/2的产生，从而减少了抗肿瘤药物的毒副作用，提高其疗效。Tregs还是一种潜在的免疫治疗手段。TGF-β可通过miRNA-183调节并降低DAP12的功能，从而降低免疫细胞杀伤吞噬和抗原递呈等作用。关于Treg中Foxp3的表达调控机制, Foxp3是Treg中最重要的调节因子，它的表达或可以决定生发中心寿命。

3.靶向Tregs在肿瘤治疗中的作用

3.1 靶向信号通路

    调节性T细胞（Tregs）对自身免疫性疾病（AIDS）的发生、发展和预后起至关重要的作用, Tregs治疗正逐渐成为肿瘤治疗的一个新靶点。 近年来随着对其生物学特性和作用机制认识的不断深入,Tregs越来越多地被应用于临床各种恶性肿瘤的免疫预防与治疗之中。尤其对于晚期非小细胞肺癌来说，有着独特的优势。 许多学者研究发现，Treg可以降低机体免疫反应，促进肿瘤在体内生长，扩散，以及转移，因此可以作为肿瘤预后的重要参考指标[7]。Treg细胞在浸润肿瘤组织过程中需要有特定趋化通路来介导，例如CCR4-CCL22, CCR4-CCRL17, CCR5-CCL5或者CXCR4-CXCL12.所以在使用药物阻断上述途径后，能够有效地切断Treg细胞的趋化途径并降低肿瘤组织中Treg细胞数，进而提高抗肿瘤免疫反应的能力[11, 12]。 

    另外,CCR5-CCL5通路对Treg细胞的趋化有重要影响。最近研究显示CCR5-CCL5经ERK1-2-P38途径可促进许多肿瘤细胞增殖、迁移及浸润。如CCR5-CCL5经ERK1-2-P38通路对口腔鳞癌的浸润及转移具有促进作用

[14]。有研究报道CC类趋化因子配体5 [chemokine, C-Cmotif, ligand 5, CCL5]及其受体（CCL5 receptor, CCR5）所构成的生物轴会重点影响乳腺癌细胞生长和转移，并且能够募集与肿瘤相关的免疫抑制细胞。 乳腺癌早期发病的病因和症状不明显，且有很强的耐药性，尤其是针对于现有的化疗药物。在目前阶段尚无有效靶向治疗药物，因此乳腺癌的复发率极高、预后不良。 然而，传统化疗药物如环磷酰胺等对晚期非小细胞肺癌有一定疗效，但不能有效控制其发展为中晚期患者；而放疗、手术或化学治疗又会导致严重并发症。因此寻找新的靶向治疗手段已成为当今乳腺癌的研究重点之一。

     Treg细胞的主要生物学功能为免疫抑制与免疫耐受，可通过器官移植进行靶向治疗。Treg细胞可以减少外来抗原（例如同种异体抗原）的免疫反应，因此通过刺激患者体内的Treg细胞增殖和恢复可以明显降低移植物带来的排异反应。

3.2 靶向药物治疗

    研究已经证明低剂量12(单剂0.33~450万(U） 能够选择性促进Tregs(Effector T cells, Teff) 发育并维持而无需激活效应T细胞，所以使用低剂量1L-3已经成为自身免疫性疾病治疗的新途径[16]。另外，已有研究证实第二代靶向CD25白喉融合毒素S-DAB-IL-2(V6A）可显著降低黑色素瘤小鼠Treg细胞数，抑制肿瘤发生，显着降低血管渗漏综合征（VDS）的发病率[17]。但值得关注的是Treg细胞作为一种重要的免疫抑制性细胞在体内保持着免疫平衡，一味地杀伤耗竭是不足取的，所以后续的药物研发还需进一步研究和寻找瘤中Treg细胞特异性靶点才能减少毒副反应，增强疗效，进而使更多的患者受益[11]。

4.总结和展望

   Treg是TME的重要一员，其对肿瘤发生发展的影响正逐渐成为肿瘤治疗的一个研究重点。TME中绝大量数Tregs既可通过分泌抑制性细胞因子来抑制肿瘤免疫又可促进肿瘤的发生、发展及转移。Tregs浸润关系到多数恶性肿瘤预后不良。有研究证实Tregs过多或过低的功能削弱均可使免疫系统产生过激反应，进而可导致自身免疫性疾病，过多或过高的异常激活则可抑制免疫反应的进行，与多种肿瘤的发病有密切关系[16]。随着自身免疫性疾病（Tregs）研究的不断深入，人们发现Tregs在不同实验对象或者血液系统肿瘤中的重要作用，包括但不限于帮助肿瘤逃避免疫反应以及免疫系统监控[7]。当前在众多靶向治疗Tregs的方案当中，最令人头疼的问题就是如何实现最优方案和筛选出对Tregs效果最好。所以Treg靶向结合其它疗法不失为一种良好的方案，找到有效的药物方案或许能取得较好的肿瘤免疫治疗作用。

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