低剂量螺旋CT筛查联合肺泡灌洗液甲基化检测对早期肺癌的研究

低剂量螺旋CT筛查联合肺泡灌洗液甲基化检测对早期肺癌的研究

曾茄，王汉，陈旭萍，赵世财，赵凌燕，伏籽桥，李知书，赵诤，石平（通讯作者）

四川省广元市中心医院 628000

【摘要】目的：通过在早期肺癌疾病患者临床检查过程中采取低剂量螺旋CT（LDCT）筛查方式联合肺泡灌洗液甲基化检查方式进行诊断，分析研究上述两种方式联合诊断对早期肺癌疾病的临床应用效果。方法：通过对2019年5月至2022年1月广元地区人群开展健康体检的群体，且经过检查后疑似患有早期肺癌疾病患者人数共计400例，将其视为本次观察对象。采取低剂量螺旋CT筛查后，联合开展肺泡灌洗液甲基化检查方式，进而探究两种方式临床诊断效果。结果：联合检查诊断效果与病理学诊断结果，无明显的统计学差异（P<0.05）。结论：采取LDCT联合肺泡灌洗液甲基化检测方式使用在早期肺癌疾病筛查过程中，临床诊断效果明显，具有较高灵敏度与特异性，值得推荐使用。

【关键词】低剂量螺旋CT筛查；肺泡灌洗液甲基化检测；早期肺癌，临床研究分析

肺癌疾病作为临床治疗过程中的一种恶性疾病，且具有高发生率与高死亡率的临床特点。在人们生活习惯与饮食习惯不断变化的当前，肺癌疾病的发生率与死亡率呈明显的增长趋势，早期对肺癌疾病的诊断工作已然成为对此疾病患者诊断与治疗的重要内容，且开展肺癌疾病筛查措施作为现阶段可以有效诊断早期肺癌疾病的重要措施[1]。临床所采取的肺癌筛查技术通常有血清肿瘤标志物以及胸部X线等一系列筛查方式，但是临床筛查效果不太理想，进而不能广泛地推广与使用[2]。反观低剂量螺旋CT筛查方式其图像分辨率相对比较高，并且对检查过程中所使用的放射剂量相对较低等优势，在对高危肺癌疾病人群中使用率较高。

1、资料与方法

1.1基本资料

通过对2019年5月至2022年1月广元地区人群开展健康体检的群体，且经过检查后疑似患有早期肺癌疾病患者人数共计400例，将其视为本次观察对象。年龄主要分布在24-59岁之间，均值为（46.67±9.36）岁，男女之比为206：194；疑似早期肺癌疾病患者基本资料各方面（年龄与性别）等比较均明显不存在统计学差异（P>0.05），可对其进行对比分析。参与本研究患者均对研究环节与内容表示知情，且自愿与我院签订声明协议，本研究在我院伦理委员会批准同意后才开展。

1.2方法

1.2.1低剂量螺旋CT筛查方式

首先，将LDCT扫描参数设置在120kV，30mA，常规扫描重建层厚设置在5mm，薄层重建层原则设置在1.5mm。其次，从患者的胸廓入口到肺低开展连续的扫描检查工作。使用肺窗与纵隔窗对患者CT图像进行检查，其中肺窗窗宽控制在1200HU，窗位控制在－600HU；纵隔窗窗宽控制在400HU，窗位控制在35HU中[3]。对检查所获得的影像学结果均安排两位我院临床影像科工作经验丰富的医师对患者进行初诊，在安排专科医师对结果进一步复诊，对患者肺实质、支气管腔内结节（大小、位置、性质以及形状）等方面内容做好对应的记录工作。结合结节所遮盖肺实质的差异性，将其划分为三种结节情况（实性、部分实性以及非实性），其中非实结节又可将其划分为磨玻璃密度影以及磨玻璃密度结节两种情况[4]。关于结节直径方面，在CT图像肺窗中最大结节横截面上长径和垂直短径两者之间的均值，病史使用系统配置的电子测量尺对其进行测量，当存在最少一个直径高于4mm的非钙化结节则可以视为LDCT筛查结果为阳性[5]。最后有专科医师结合CT影像学结果以及患者临床症状表现对疑似存在结节的阳性患者开展复查以及诊断。

1.2.2肺泡灌洗液（SHOX2及RASSF1A）甲基化检测方式

根据亚硫酸盐修饰和Real-time PCR（Taqman探针法）技术对患者开展支气管肺泡灌洗SHOX2及RASSF1A甲基化检测工作，使用亚硫酸盐对没有被甲基化的C碱基演变为U碱基，在进行PCR扩增时，再改变为T碱基，但是甲基化中C碱基保持不变，为此能够有效分辨出甲基化以及未甲基化的C碱基。其次，使用Taqman探针对扩增产物展开临床检查工作，利用优化反应体系以及高特异Taq酶，将样本放置在实时荧光PCR平台中开展甲基化DNA特异检测处理。使用FAM荧光对RASSF1A基因甲基化DNA情况进行检测，使用VIC或者HEX荧光法对SHOX2基因甲基化DNA情况进行检测，应用CY5荧光对内标基因B-actin水平进行检测。

（1）DNA提取：采取5-10ml的肺泡灌洗液，对其进行离心（转速控制在每分钟2000r）五分钟后，丢弃上清液，保留大约200ul液体样本，将其重悬放置在1.5ml的EP管中；随后对检测样本依次添加20ul的Proteinase K，200ul Buffer GL，使其充分混合。在对其进行瞬时离心处理后，将管盖中的液体离心到管底位置，放置在温度未56°C的金属浴中孵育十分钟，每间隔2-3分钟对其进行混匀处理。在向其中滴加200ul无水乙醇，时期均匀混合，进行瞬时离心。在将EP管中的液体放置在收集管吸附柱中，尤为值得关注的是，枪头不宜和滤膜相接触，避免导致滤膜被捅破。在对其进行离心（转速控制在10000r）一分钟后，吸附柱更换一个新的收集管。在朝吸附柱中使用Buffer GW1（剂量未500ul），离心（转速控制在10000r）一分钟后，将收集管中的废液清除。再次朝吸附柱中使用Buffer GW2（剂量为500ul），离心（转速控制在10000r）一分钟后，将收集管中的废液清除。开展离心（转速控制在10000r）二分钟后，在室温静置五分钟。随后使用新的1.5ml的EP管，对吸附柱中使用Buffer GE（剂量为50-100ul），室温静置五分钟后，对其进行离心（转速控制在10000r）一分钟，采集DNA溶液。对于所采集DNA中，在四十八小时内进行检测时，应该将其放置在2-8°C中保存。反之检测时间超过四十八小时，则应该将其放置在低于－20°C中保存，保存时长不应该超过半年。

（2）DNA亚硫酸盐修饰：

对于所采集的DNA样本开展亚硫酸盐修饰以及修饰后纯化，大约需要四小时。首先切实根据需要DNA样本实际数量，备好对应的PCR反应管，在每天PCR反应管中滴加CT转化试剂（剂量为130ul），则根据顺序滴加DNA样本（剂量为20ul），当DNA样本体积西域20ul时，则应该使用适当的水来减少差异。其次，将PCR反应管放置在PCR检测仪器反应板中，并且盖好热盖（需温度保持在98°C中，时间为八分钟；其中温度保持在64°C中，时间为3.5小时；最后，反应完成后，进行纯化或者保存在温度为4°C环境中）。在备好的纯化柱与收集管（与DNA样本数量一致）作为对应的样本标记，将纯化柱放置于收集管中。在纯化柱中滴加缓冲液（剂量控制在600ul），将反应产物放置在纯化柱汇总（其中包括600ul融合缓冲液），使其均匀混合。在对其进行离心半分钟（转速控制在12000r），随后丢弃废液。对纯化柱滴加洗涤剂（剂量为100ul），离心半分钟（转速控制在12000r）。再对纯化柱滴加去磺酸化液（剂量为200ul），将室温为20-30°C中孵育放置13-20分钟后，离心半分钟（转速控制在12000r）。再使用洗涤液（剂量为200ul）放置于纯化柱中，离心半分钟（转速控制在12000r）；再增加同等剂量的洗涤剂，重复离心工作。将纯化柱放置在作为标记的1.5ml的EP管中，滴加洗脱液（剂量为20ul）至洗脱液中，离心半分钟（转速控制在12000r），进行DNA洗脱工作。

1.3评判标准

将病理学检测结果视为金标准，比较两种检测方式下早期肺癌疾病患者诊断效果。

1.4统计学方法

通过将本次研究所得所有的数据均放置于SPSS24.0统计学软件对其进行计算，其中计数资料使用百分率（%）进行表示，并且采取X2对计数资料进行检验。当（P<0.05）时则表示存在统计学差异。

2、结果

2.1诊断效果对比

在400名检查者中均对其开展LDCT检测、肺泡灌洗液甲基化检测，通过病理学结果可知在400名受检者中有21例早期肺癌疾病患者。联合检查诊断效果与病理学诊断结果，无明显的统计学差异（P<0.05），由此可见，联合检查的准确率较高。

表1 诊断效果[400,(%)]

3、讨论

在全世界中死亡率最为突出的恶性肿瘤疾病为肺癌，并且此肿瘤疾病的发生率与死亡率还不断增加，为此对于高危患者实际开展筛查工作，对其疾病早确诊以及早治疗等均存在积极作用。有相关临床研究表明，开展肺癌筛查工作可以有效地降低肺癌疾病患者出现死亡情况的发生概率[6]。当前临床对于肺癌疾病检查结果黄金标准是开展病理学检查，但是因为早期肺癌疾病通常发生在直径低于1cm的结节中，通常情况下采取活体组织样本开展病理学诊断工作难度较高。

早期对于肺癌疾病所采取的筛查方式主要有肿瘤标志物、细胞学等检查措施，但是灵敏度相对较低，且对于肺部小结节具体病变的良性与恶性的鉴别难度相对较高。有相关临床研究表明，通过采取低剂量螺旋CT对早期肺癌疾病进行筛查工作，与胸部X片相比，具有较为理想的敏感性[7]。并且以往所采取的胸片X线检查方式出现漏诊与误诊的概率较高，但是反观低剂量螺旋CT其存在明显的时间分辨率以及空间分辨率等优势，可以结合容积扫描对早期肺癌疾病进一步临床诊治[8]。此种筛查方式通过降低辐射剂量的同时，还可以明显降低对受检者正常身体组织所带来的辐射损伤程度，一定程度上保护受检者身体安全。但是此种筛查方式所检查出来的肺部肿块其性质辨别度较低，通常会采取其他侵入性诊断方式对肿块性质进行区别，利润活检等措施，从而进一步诊断患者有无患有肺癌疾病。使用率较高的支气管活检以及肺部穿刺此两种侵入性诊断措施，可能会导致受检者出现一系列并发症情况，且一次检查成功率较低，可能会对患者造成二次伤害，为此不宜推广。伴随着纤支镜不断发展与进步，支气管肺泡灌洗术也随之发展，此种技术通过将纤维支气管镜对人体支气管以及肺段相关位置，采取无菌生理盐水进行多次灌洗后回收出来，在对所采取的灌洗液开展临床检查，进而有效地为临床诊断呼吸道疾病提高良好的参考依据。支气管肺泡灌洗液存在无污染以及较高特异性等优势，在此基础上，对患者开展甲基化检查工作，在对SHOX2以及RASSF1A开展基因甲基化检查工作，可以切实的关注到上述两种基因在肺癌疾病患者中甲基化具体状况。从本次研究结果可知，通过将LDCT筛查联合肺泡灌洗液甲基化检测使用于对早期肺癌疾病的检测过程中，与病理学检测结果相比，无统计学差异，且联合检测方式对于早期肺癌疾病具有较高敏感性与特异性的检测优势，进一步提高对早期肺癌疾病的临床诊断率，有利于为临床治疗早期肺癌疾病患者提供良好的参考依据。

综上，将LDCT与肺泡灌洗液甲基化此两种检测方式联合使用在对早期肺癌疾病筛查过程中，可以提高临床对此疾病的诊断价值，值得推广普及。

参考文献

[1] 刘家杰, 肖泽林, 庄仕龙. 高分辨CT三维重建联合肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测诊断早期肺结节的效能分析[J]. 中国实用医药, 2021, 16(17):3.

[2] 王月花, 宋昱晨. 肺泡灌洗液p16,MGMT,FHIT和APC甲基化对肺癌早期筛查的价值[J]. 浙江医学教育, 2020, 19(2):4.

[3] 杨敬平, 杨俊俊, 周婵,等. 肺泡灌洗液在肺癌早期诊断方面的研究进展[J]. 中华肺部疾病杂志：电子版, 2020, 13(1):3.

[4] 王卫中, 周铭辉, 李丹丹. CT联合CTC检测对GGO患者早期肺癌的诊断价值[J]. 中国CT和MRI杂志, 2022, 20(1):3.

[5] 王皓飞, 胡文瀚, 宋倩文,等. 肺泡灌洗液和血浆中外泌体含量与早期急性呼吸窘迫综合征患者肺损伤严重程度及预后的关系[J]. 中华医学杂志, 2022, 102(13):935-941.

[6] 孙良璋, 李建忠, 张丹杰,等. 低剂量螺旋CT联合7种肺癌自身抗体检测对早期肺癌的筛查价值[J]. 癌症进展, 2021, 19(4):4.

[7] 郭俐君, 马雯. 低剂量螺旋CT联合血清CEA,CYFRA21-1,NSE检测对早期肺癌的筛查价值[J]. 临床研究, 2021, 29(12):3.

[8] 赵志雄, 刘铁军, 肖运平. 低剂量螺旋CT在早期肺癌筛查中的应用研究综述[J]. 中外医疗, 2020, 39(13):3.

四川省医学会科研计划项目（S20030）