Time-lapse分析ICSI胚胎早期动态学参数对妊娠结局的影响

Time-lapse分析ICSI胚胎早期动态学参数对妊娠结局的影响

李明颖，武泽，杨瑾溪，丁磊，李永刚

   650032  云南省昆明市，云南省第一人民医院生殖医学科

摘要：目的：获得单个健康的活产婴儿是辅助生殖治疗的最终目的，本研究利用Time-lapse技术，观察分析单精子卵胞浆内注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治疗患者早期胚胎的相关动态学参数，研究其对妊娠结局的影响。方法：通过常规条件培养和Time-lapse培养后临床结局的比较，探讨Time-lapse培养的安全性和可行性；对行Time-lapse培养的胚胎，分析各早期动态学参数之间的联系，及其对妊娠结局的影响。结果：Time-lapse培养组患者临床结局略优于常规组患者，早期动态学参数对妊娠结局无显著性影响，但妊娠组的早期动态学参数出现的时间略早于非妊娠组。

关键字：ICSI，Time-lapse培养，胚胎早期发育动态学参数

前言

多胎妊娠会带来妊娠期高血压、早产、剖宫产等多种风险[1],同时也会导致新生儿疾病如早产和低出生体重。为了提高妊娠率，多胎移植曾被普遍用于ART技术。如今随着技术发展，获得单独健康的婴儿成为ART的主要目的[2]. 降低多胎妊娠最有小的方法是减少移植胚胎数,尽管如此，目前，选择性单胚胎移植并不能被普遍接受，主要是考虑到病人对SET带来的妊娠率降低的接受度[3]。如何挑选最具种植潜能的胚胎，在合理的临床结果和低多胎妊娠率之间保持平衡，是如今胚胎学家面临的巨大挑战。

研究认为，囊胚培养可以选择更优发育潜能和染色体正常的胚胎移植，单囊胚移植在维持妊娠率和活产率的同时，可以显著降低多胎率。但囊胚培养增加工作量和培养成本，同时可能带来表观遗传的改变。在传统形态学参数评估系统，基于胚胎发育速度和发育过程中的静态形态学参数同发育潜能并不完全相关[4]，因而对胚胎发育和临床结局的预测能力有限。近年Time-lapse胚胎实时观察系统可以不间断的观察胚胎发育情况，捕捉胚胎发育影响，极大地增加了胚胎观察的频率，收集更多的胚胎发育时机和形态学变化的动态信息，提出了一些新的胚胎发育相关的动态学参数。目前已有一些Time-lapse研究讨论胚胎发育过程中的一些时间点及事件同胚胎发育潜能以及种植率的相关性，并确定了个别公认的胚胎发育关键参数[5][6][7][8][9][10][12]，相对与传统形态学评估系统选择胚胎，种植率会有提高[9] [11][13][14][15][16]。分裂到5细胞的时间如果在理想时间段内，种植率较好[8][12]，另外一些异常发育情况例如受精卵直接分裂为3细胞、2细胞期大小不一、4细胞期多核等，对胚胎发育和种植有严重的负面影响[8][9][10]。

1. 资料与方法

1.1 研究对象

从本中心2014.6-2014.11月行ICSI周期病人中随机选择获卵数5-16枚的191例病人分成两组，一组行常规条件培养，一组行Time-lapse培养，行双胚胎移植，两组年龄和获卵数均无显著性差异。

1.2 动力学参数设置

除了目前已有的早期胚胎的动力学参数外（见表1），增加tpb（第二极体出现时间）、tpn（原核出现时间）、tpnd（原核消失时间）、L1（第二极体出现到原核出现时间差）、L2（原核持续时间）、L3（原核消失到初次卵裂时间差）等参数。

表1 胚胎动力学研究参数

1.3 统计方法

移植后评估指标有临床妊娠率、种植率、活产率和多胎率。移植7周后超声监测到孕囊定义为临床妊娠。使用SPSS20.0 (Armonk, NY, USA: IBM Corp.)进行统计分析：不同组之间年龄、获卵数及临床结果差异使用独立样本t检验或者χ2检验分析（P<0.05认为有显著性差异），各参数之间的相关性采用Pearson相关性分析（P<0.05认为有显著相关性）。

2. 结果

2.1 Time-lapse组患者临床结局略优于普通培养组患者

Time-lapse组共27例病人，平均年龄33.74，平均获卵数8.70；常规组164例，平均年龄32.19，获卵数9.24。两组患者在平均年龄和获卵数上无显著性差异。Time-lapse组的临床妊娠率、种植率均高于常规组，但没有显著性差异。

表2. Time-lapse组和常规组临床指标比较

2.2 ICSI患者胚胎早期动态学参数对临床结局的影响

将ICSI受精时间记为0hr，根据Time-lapse标记，计算各胚胎动态学参数出现的平均时间，见表3。

表3. 各动态学参数出现时间

将Time-lapse培养组患者根据是否妊娠分为妊娠组与非妊娠组。早期胚胎动态学各参数在妊娠组与非妊娠组之间无显著性差异，详见各表4：

表4. 妊娠组与非妊娠组之间各动态学参数的比较

从妊娠组与非妊娠组之间各参数比较可看出，妊娠组第二极体的出现、原核的出现和消失、初次卵裂的出现均早于非妊娠组。第二极体出现到原核出现的时间差（L1）、原核消失到初次卵裂的时间差（L3）小于非妊娠组。妊娠组原核持续时间较长（L2）。

2.3 早期胚胎异常分裂对临床结局的影响

在本研究中，我们观察从初次卵裂到4细胞异常的细胞分裂情况，包括直接分裂为3细胞、出现3细胞到2细胞的倒退等。其中1例病人2个移植胚胎均存在异常，无妊娠；2例病人有1个胚胎出现异常，均为单胎妊娠。

讨论

辅助生殖技术发展至今，随着技术的进步，治疗妊娠率不断提高。辅助生殖治疗的目的已从获得高的妊娠率转变为获得单个健康活产婴儿。胚胎移植数量的增加在提高妊娠率的同时，也会极大的增加多胎率。研究表明，单个优质囊胚移植在提高妊娠率和降低多胎率上有着显著的优势[17]。但是，囊胚培养延长了胚胎体外培养的时间，可能会带来表观遗传的改变，其对胎儿的后续发育影响尚未可知。。同时，有近半数的胚胎在延长培养中无法获得囊胚，降低了患者对囊胚培养的接受度。目前接受度较高的传统的形态学评估具有一定的局限性，只能在单一的时间点获得胚胎观察数据，无法对胚胎整个发育过程进行连贯的评估。Time-lapse培养可以连续的对胚胎进行观察，因而获得更多的有价值的胚胎发育动态学参数，同时可以观察到传统胚胎评估无法获得的胚胎发育异常的数据。另外由Time-lapse培养不需要取出胚胎观察，避免了培养箱反复开关，也减少了胚胎在培养箱外观察时环境的不良影响，对胚胎的干扰更小，安全性有保障。

我们的研究表明，相对于传统培养的患者来说，Time-lapse培养组患者的临床妊娠率和种植率都略有提升。进一步证明了Time-lapse培养的安全性和优势。同时在Time-lapse培养的患者中，相较于非妊娠组，妊娠组中早期动态学参数出现的时间更早，且第二极体出现到原核出现的时间差、原核消失到初次卵裂的时间差均小于非妊娠组，提示，妊娠组各胚胎发育事件出现较早，且各事件之间的连接更为紧密。妊娠组原核持续时间较长，提示该组中第一次有丝分裂期时间更长。由于本研究的研究对象为双胚胎移植患者，在结果的分析上可能会存在干扰，在后续研究中，选择单胚胎移植病人能更真实的反应动态学参数同妊娠结局的关系。另外，我们的研究发现出现异常分裂的胚胎移植后都未妊娠，提示出现异常分裂的胚胎无法继续着床获得妊娠。但由于研究病例较少，无法获得有统计学意义的结果，后续将继续扩大研究样本量，获得更多有意义的临床数据。

综上所述，Time-lapse培养在不影响胚胎培养和移植后临床结局的前提下，可以获得更多与胚胎早期发育相关的动态学参数，同时可以观察到胚胎异常发育的现象，预测胚胎发育的结局，为移植胚胎的评估和选择提供更有力的依据。

参考文献

1.Feng G, Zhang B, Zhou H, Shu J, Gan X, Wu F, Deng X. Comparable clinical outcomes and live births after single vitrified–warmed and fresh blastocyst transfer. Reprod Biomed Online. 2012; 25 (5):466-73.

2.ESHRE Campus Course Report. Prevention of twin pregnancies after IVF/ICSI by single embryo transfer. Hum Reprod. 2001; 16:790–800

3.Pandian Z, Templeton A, Serour G, Bhattacharya S. Number of embryos for transfer after IVF and ICSI: a Cochrane review.

Hum Reprod. 2005; 20:2681–7.

4.ESHRE/ALPHA. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Hum Reprod. 2011; 26:1270–1283.

5. Lemmen JG, Agerholm I, Ziebe S: Kinetic markers of human embryo quality using time-lapse recordings of IVF/ICSI-fertilized oocytes. Reprod Biomed Online. 2008; 17:385–391.

6. Azzarello A, Hoest T, Mikkelsen AL: The impact of pronuclei morphology and dynamicity on live birth outcome after time-lapse culture. Hum Reprod. 2012; 27:2649–2657.

7.Wong CC, Loewke KE, Bossert NI, Behr B, De Jonge CJ, Baer TM, Reijo Pera RA: Non-invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predicts development to the blastocyst stage. Nat Biotechnol. 2010; 28:1115–1124.

8.Meseguer M, Herrero J, Tejera A, Hilligsoe KM, Ramsing N, Remohi J: The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Hum Reprod. 2011; 26:2658–2671.

9.Rubio I, Kuhlmann R, Agerholm I, Kirk J, Herrero J, Escriba M-J, Bellver J, Meseguer M: Limited implantation success of direct-cleaved human zygotes: a time-lapse study. Fertil Steril. 2012, 98:1458–1463.

10.Cruz M, Garrido N, Herrero J, Perez-Cano I, Munoz M, Meseguer M: Timing of cell pision in human cleavage-stage embryos is linked with blastocyst formation and quality. Reprod Biomed Online. 2012; 25:371–381.

11.Meseguer M, Rubio I, Cruz M, Basile N, Marcos J, Requena A: Embryo incubation and selection in a time-lapse system improves pregnancy outcome compared with standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 2012; 98:1481–1491.

12.Chamayou S, Patrizio P, Storaci G, Tomaselli V, Alecci C, Ragolia C, Crescenzo C, Guglielmino A: The use of morphokinetic parameters to select all emrbyos with full capacity to implant. J Assist Reprod Gene.2013; 30:703–710.

13.Dal Canto M, Coticchio G, Mignini Renzini M, De Ponti E, Novara PV, Brambillasca F, Comi R, Fadini R: Cleavage kinetics analysis of human embryos predicts development to blastocyst and implantation. Reprod Biomed Online.

2012; 25:474–480.

14.Kirkegaard K, Kesmodel US, Hindkjaer JJ, Ingerslev HJ: Time-lapse parameters as predictors of blastocyst development and pregnancy outcome in embryos from good prognosis patients: a prospective cohort study. Hum Reprod. 2013; 28:2643–2651.

15.Kahraman S, Cetinkaya M, Pirkevi C, Yelke H, Kumtepe Y: Comparison of blastocyst development and cycle outcome in patients with eSET using either conventional or time lapse incubators. A prospective study of good prognosis patients. J Reprod Stem Cell Biotechnol. 2012; 3(2):55–61.

16.Rubio I, Galán A, Larreategui Z, Ayerdi F, Bellver J, Herrero J, Meseguer M: Clinical validation of embryo culture and selection by morphokinetic analysis: a randomized, controlled trial of the EmbryoScope. Fertil Steril. 2014; 102(5): 1287-1294.

17. 李明颖,马艳萍,高梦莹,邓波,邓莲,相立峰,李永刚. 囊胚质量对冻融胚胎移植临床结局的影响及囊胚移植选择策略. 实用医学杂志. 2018. 34(15)：2453-2456.