诺如病毒实验室诊断现状与展望

诺如病毒实验室诊断现状与展望

罗梅

修文县疾病预防控制中心 550200

【摘要】诺如病毒能够引起腹泻，也是病毒性急性肠胃炎的主要病因，严重影响着当下公共卫生与食品安全。诺如病毒基因组具有多样性，且病毒也在不断变异，这也就导致临床尚未研发出疫苗进行病毒控制。诺如病毒实验室诊断方法类型较多，不同检测技术间的检测原理具有差异，此类实验室检测技术对促进诺如病毒实验室诊断工作的发展具有重要价值，能够满足现代化临床病毒诊断的需求，为临床治疗提供依据。基于此文章就诺如病毒实验室诊断现状以及未来发展展开阐述。

【关键词】诺如病毒 实验室诊断 诊断技术

诺如病毒属于一组圆形、无包膜的单股正链RNA病毒，属于环状病毒科诺如病毒属。若如病毒的感染性腹泻是诺如病毒的主要临床症状，此类疾病具有发病急、传播速度快、传播范围广等特点，也是爆发性非细菌性腹泻的主要病因。从诺如病毒感染性来讲，诺如病毒以肠道传播为主，受到污染的水、食物，甚至空气均有较高的传播性，因此诺如病毒在学校、社区容易出现集体感染。诺如病毒自身遗传具有高度变异的特征，同一社区在同一时间所存在诺如病毒毒株具有差异，为减少诺如病毒的感染与传播，预防与控制感染对阻断病毒爆发具有重要价值。实验室检测作为检测诺如病毒最快、最直观的方式，近年来诺如病毒实验室诊断技术也在不断简化、诊断精准性也在不断提升。

一、诺如病毒表型以及免疫学检测方法

电子显微镜对诺如病毒的检测十分简单，其仅需要少量样本进行简单处理，便可直观从外形的角度对诺如病毒进行分辨。电子显微镜对区分小圆病毒的敏感性较差，由于诺如病毒与札幌病毒、星状病毒外形具有相似性，以此单纯电子显微镜难以对诺如病毒进行诊断。根据当下研究资料统计，有学者研究证明，在对2000余份粪便样本进行检测的过程中，有超100分的阳性样本尚未在电子显微镜下被检出。由此电子显微镜对诺如病毒的灵敏性较低，且设备自身维护成本较高，不适用于临床诊断。

2003年以来，诺如病毒抗原检测方法在不断更新，受其检测方法快速、操作简单等优势，被广泛应用于诺如病毒抗原的检测中。

常见检测方法为：传统96微孔板的酶免疫测定法、快速膜基免疫层析法以及生物素发光法。当下临床可应用的诺如病毒抗原检测十分受限，这主要是缺乏可用于捕获及检测高变异诺如病毒的保守性抗原的特异性抗体。诺如病毒抗原高度多样，此类检测方法敏感度与电子显微镜相比较为敏感，但就病毒检测敏感度来讲仍然较低。现阶段诺如病毒多种抗原检测试剂盒正在研发，但其检测诊断结果仍处于观望阶段。

二、以核酸为基础的诺如病毒检测

2.1 常规c RT-PCR技术

c RT-PCR是指在核酸扩增过程中，扩增产物积累在进行检测前伴随热循环完成或终止时达到平台。PCR产物主要是采用琼脂糖或者聚丙烯酰胺凝胶电泳进行的长度判断，以此对扩增的PVR产物进行检测。临床学者就这一技术进行了鉴定，研究表明，c RT-PCR在诺如病毒检测中的应用具有步骤频繁、复杂且检测耗时较长的特点，此类检测过程效率难以保障，存在一定的污染性。为减少此类技术短板，设计型特异性引物，以促进c RT-PCR技术应用的广泛性，当下c RT-PCR在诺如病毒进化的分子流行病学调查。PCR扩增产物测序广泛应用于诺如病毒株的基因变异研究，以及爆发性诺如病毒流行的研究。

2.2 等温扩增技术核酸序列依赖性扩增

技术和环介导等温扩增技术属于等温扩增法，其主要应用于诺如病毒的粪便样本检测。此方法属于单一温度条件下的扩增，无需热循环仪器的使用，具有实时PCR的特点，且检测过程具有较高的敏感性。等温扩增技术核酸序列依赖性扩增技术能够用于诺如病毒RNA的检测，但其特异性在当下尚未达到临床诊断要求，且在温度条件较低（-40℃）的情况下扩增病毒RNA特异性不明显。技术和环介导等温扩增技术具有检测速度快、操作性简单、反应时间短等技术优势，同时其对温度要求较低，一般温度控制在60-65℃，无需大型设备进行温度控制。同时此技术结果的判读只需观察浑浊度即可，也可添加金属荧光剂提高浊度的可读性。技术和环介导等温扩增技术在当下GI和GII型的诺如病毒检测中应用广泛，可提供与实时荧光定量反转录PCR相当的检测结果。

2.3 q RT-PCR技术

q RT-PCR技术原理主要为通过非特异性荧光染料偶联到目标特异性探针上，以实时检测特异性的核酸生成，每一轮PCR循环后均可检测到扩增产物。q RT-PCR技术具有灵敏度高、特异性强的特点，此类技术特点是检测诺如病毒的主要标准。有学者对基于TaqMan探针，用于定量检测的GI和GII型的诺如病毒就q RT-PCR技术进行评估，结果表明，此技术对GII型病毒的灵敏度较高，且未与其他常见肠道病毒产生交叉反应，因此具有较强的分析灵敏度。q RT-PCR技术在当下诺如病毒的检测过程中应用十分广泛，但此检测技术难以区分致病性诺如病毒颗粒与非致病性诺如病毒颗粒，同时检测结果受食品样品基质中分子检测抑制剂的影响，检测结果存在准确性问题。因此技术应用过程中，可通过PGM对具有活性的病毒粒子进行分离，此后再开展q RT-PCR技术检测，以确保技术检测结果的精准性。

2.4数字PCR

微滴式数字PCR是通过对样品进行微滴化处理，处理过程中含有待测靶核酸分子的微滴产生荧光信号，根据阳性微滴的比例以及泊松分布原理实现对目标待测物的检测。微滴式数字PCR技术有效的克服了实时PCR需要依赖外部标准曲线的局限性，其在临床检测中逐渐代替q RT-PCR技术。作为第三代PCR技术，微滴式数字PCR技术灵敏度更高，且不受基质抑制的影响，能够对食品与环境样本中的低水平诺如病毒进行精准检测。我国有学者就微滴式数字PCR技术进行研究，将此技术应用至冷冻草莓的GI和GII型诺如病毒检测过程中，研究结果表明，此技术能够在稀释后的样本检测中，实测拷贝数浓度低至1.8拷贝/μL，这也就彰显着这一技术的灵敏度。伴随此项技术的创新与应用，越来越多的研究人员与实验室检测人员将其应用至食源性致病微生物的检测过程中。当下此类技术受仪器成本的影响尚未得到广泛应用，但其在诺如病毒检测中的精准性较高，在未来实验室检测中具有较高的临床诊断价值。

2.5基因分析检测

基因分型能够就诺如病毒的基因进化、分子流行病学特征进行表现，此类检测方式多存在于研究机构与公共健康实验室。人类诺如病毒可分为不同的基因组、基因型与突变株，从诺如病毒基因组来讲，基因组具有高度多变性特定，因此基因分型需要结合RT-PCR扩增产物进行测序鉴定。根据基因组A-E的5个不同区域可对诺如病毒基因分型。当下有研究证明，基于C、D、E区设计的外壳蛋白基因引物在基因分型中具有独特价值，这主要得益于外壳蛋白对宿主受体相互作用、免疫应答以及相关的基因突变信息的直接反应。基于此外壳蛋白全基因测序是当下诺如病毒基因分型的金标准。

2.6高通量测序

高通量测序技术作为下一代基因测序，其在当下实验室检测与诊断中的应用十分广泛，技术自身具有较高的检测灵敏度与高通量特点，且技术成本可控，诊断与检测精准性较高，此类优势促进着高通量测序在当下诺如病毒基因组学中的研究。伴随当下测序技术的创新与发展，高通量测序能够从临床样本中有效的鉴定诺如病毒常见株及突变株，同时技术能够对诺如病毒基因进化与新突变株进行追踪，以预防诺如病毒潜在性胃肠炎的爆发。

三、诺如病毒实验室诊断展望

当下诺如病毒实验室检测方法优缺点十分明显，因此在具体检测技术的应用过程中，实验室需要结合自身诊断需求与目的选择适当的诺如病毒检测技术。诺如病毒基因型具有多样性，且存在持续的基因进化特点，因此单一的特异性引物扩增难以保障检测结果的精准性。LAMP技术、纳米技术、高通量测序技术成为当下研究机构的主要方法，未来此类技术有望应用至实验室诊断工作中，以满足诺如病毒的临床诊断与服务需求。

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