基于HPLC-MS测定牛奶和奶粉中黄曲霉毒素方法的优化

基于 HPLC-MS测定牛奶和奶粉中黄曲霉毒素方法的优化

张董、周张亚

钛和中谱检测技术（江苏）有限公司 江苏南京 210000

摘要：为进一步测定牛奶和奶粉中的黄曲霉毒素，本文采用HPLC-MS方法针对牛奶和奶粉两种基质进行测定，测定方法为：通过乙酸乙腈对样品进行提取，利用氯化钠与硫酸镁实现分层，待样品得到净化后通过HPLC-MS展开测定。经过以上测定结果为：回收率均为77％-101％，牛奶和奶粉的基质效应影响均小于10%，由此可知，该方法能够在黄曲霉毒素测定中起到一定的优化作用。

关键词：HPLC-MS；牛奶和奶粉；黄曲霉毒素；测定方法

引言：牛奶和奶粉中蕴含一定黄曲霉毒素，这类毒素对于人体会产生一定危害，长期服用，会对人体造成致癌危害。对此，牛奶和奶粉在进入市场之前，需要采取一系列措施对其进行含量的测定，但由于部分测定方法较为传统，测定时间过长，测定成本较高，且测定回收率、准确率无法得到保障。因此，在测定牛奶和奶粉中的黄曲霉毒素时，应当积极运用HPLC-MS法，通过方法优势提升测定效果与准确率。

1.测定条件

1.1试剂

本次试验中所用试剂有：美国TEDIA的色谱纯乙腈；新鲜牛奶、奶粉；上海博势生物科技有限公司的分析纯C18粉；上海安谱科技公司的黄曲霉毒素标准品；上虞市双良化工设备有限公司的分析纯正己烷；国药集团化学试剂有限公司的分析纯氯化钠、硫酸镁；北京中仪宇盛科技有限公司的分析纯N-丙基乙二胺；上海阿拉丁生化科技有限公司的分析纯乙酸。

1.2仪器

本次试验中所用仪器有：沃谱达仪器苏州有限公司生产的质谱仪，型号为：AB Scies API 4000；新华医疗器械厂生产的恒温器，型号为TC-15；湖南湘仪仪器厂生产的离心机，型号为：H1850R；美国Agilent公司生产的色谱仪，型号为：Agilent 1290；美国BD公司生产的离心管，型号为Falcon；美国应用生物系统公司生产的Analyst软件。

2.测定方法

2.1确定条件

为逐步优化5种新型黄曲霉菌类毒素的酸性分离应用条件，选择合适的常用色谱柱，通常建议采用ASBEHC18或类似复合色谱柱。目前该课题研究报告采用的最适于五种酸性分离条件的常用复合色谱柱为C-18，柱温35℃，进样液流量10μl，流速0.8ml/min，色谱梯度测定程序为：3minb90%、10minb10%、12minb10%、12.1minb90%、15minb90%，2μg/l。

2.2处理样品

正确的处理方法是：取5.0g新鲜牛奶和2.0g新鲜奶粉，放入50ml塑料离心管中，奶粉基质加入2ml超纯水。在实验样本添加黄曲霉素标准溶液100μl，加1升乙腈+尼龙水20毫升，5分钟后高速搅拌，搅拌均匀，然后把样品放在50℃超纯为15分钟的超声波处理，然后高速搅拌离心5分钟，取纯化处理方法并过滤，通过不同方法进行提取，多用方法如下表所示：

表1：样品处理方法表

在50℃以下用氮气氧气气流装置吹干，加入1.0 mL乙腈+尼龙水溶解壁上残留的毒素，用0.22μm尼龙水过滤膜，放入样品瓶中。

2.3优化条件

虽然黄曲霉毒素在非金属极性有机溶剂中不溶解，但在其他有机溶剂中毒素可迅速溶解，因此常用乙酰甲醇或醋酸乙腈作为样品提取脱脂剂。尽管黄曲霉毒素和其他有毒物质难溶于水体之中,但在添加一定比例的碳水化合物的萃取脱脂过程,这些有机溶剂的脱水渗透率在提取过程中,能够切实提高提取效果与效率。这种脱水纯化处理方法具有很强的特异性，但对于乳品企业来说，这种纯化方法检测样品的成本较高，尤其是新鲜牛奶和精制奶粉样品。加水后样品易混浊，影响柱寿命长。因此，本文采用类似于5GQuecHERS脱水处理的方法，即对试验样品进行脱水提取，用正己烷处理对除脂液进行纯化，使样品的提取和脱脂更加方便、经济。

2.4测定流程

5μg/ mL黄曲霉毒素标准溶液的电喷雾吸收。用针泵注入离子源时，流速为10μ L /min。在正离子扫描条件下，通过一级质谱分析得到了一个分子碰撞离子峰。在负离子扫描模式下，活性均匀的5种黄曲霉毒素可以直接获得强的[M + H] +辐射信号，使碰撞分子离子峰的辐射强度最大化。然后，利用二级质谱对黄曲霉毒素进行初步分析,碎片碰撞使离子峰的辐射强度大大增加，这可以通过初步优化离子碰撞辐射能值实现。当离子为不稳定碰撞离子时，有必要对离子碰撞的辐射能量进行初步优化。对其他温度参数的数据进行初步调整和优化，可实现质谱的最佳检测温度条件：提高离子碰撞喷雾溶剂的电压为4500V；雾化溶剂为4.14× 105Pa；溶剂气体电压温度500℃；优化后的温度1.38× 105Pa；优化碰撞溶剂cad，0.69× 105Pa；注入溶剂气体gS2去除聚团4.14× 105Pa；进风电压EP， 10V。

3.结果分析

3.1回收率分析

在不同级别不含黄曲霉毒素的空白牛奶样本中，添加1.25，2.50，5.00ng的黄曲霉毒素，奶粉中添加1.0，2.0，4.0ng的黄曲霉毒素，并对各不同水平毒素和独立毒素进行6次综合测定。检验结果表明，按顺序添加黄曲霉毒素后，牛奶粉的加标回收率为77.06%~101.28%，RSD为2.38%~7.22%。牛奶中淀粉的加标回收率控制在57.00% ~ 99.86%，RSD为2.00% ~ 8.37%，表明该方法的回收率较好。

3.2基质效应分析

样品标准矩阵标注会对喷雾器中的样品大气压，及电离离子源矩阵产生不利影响。因此，本研究认为采用样品外标的定量方法，可以有效减少基质标效的不良影响。为了使测量结果更加准确，利用样本矩阵效应给出了工作过程曲线，从而有效地消除了操作过程设计中的系统误差。实验结果表明，乳和脱脂奶粉的基质标记效果对其均匀性影响不大，均小于10%。

3.3线性关系分析

标准品准确定量浓度曲线及检出限标准品综合定量测定，采用标准综合定量测定法测定30ng/ mL，监测样品中AFB2和AFC2的浓度，提取样品的留样时间和储存时间作为样品稳定性。然后将新样品AFB、AFG、AFB2、AFG2标准溶液，及一系列5ng/ mL、10ng/ mL、20ng/ mL、30ng/ mL、50ng/ mL样品质量标准全面定量测定。为了画出每个相应样品的标准和准确的质量测定，产品的标准浓度区分的横坐标和纵坐标，剩余留样时间为横竖同时鉴别的纵、纵坐标，并绘制相应标准、准确的样品浓度定量曲线。综合测定分析结果显示，监测的每个离子色谱峰峰的表面积，与样品相应标准质量测定产物标准浓度，在1.0~5.0ng/ml之间，在该范围内不能形成一种线性定量对比并且关系良好，r2都不能超过大于0.9990，能够充分保证满足样品标准质量样品精确定量曲线测定时的定量标准及样品质量测定要求。根据各峰的标准定量峰和监测离子峰的标准色谱峰3~10倍信噪比，计算检出限和相应样品标准定量限如下表所示：

表2：测定检出限、定量限以及线性范围详情表

结束语：总而言之，通过以上分析可以得知，利用HPLC-MS测定方法，能够有效提升牛奶和奶粉中黄曲霉毒素的测定效果、速度、准确性以及回收率，测定过程简单便捷，从根本实现黄曲霉毒素测定方法的优化。而且采用HPLC-MS进行测定后可以得知，黄曲霉毒素测定的回收率均为77％-101％，线性关系为1ng/ml-5ng/ml，在本次测定中的所得数据，符合牛奶和奶粉中黄曲霉毒素的测定标准。

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