血塞通注射液含量测定方法中有关色谱柱筛选与方法再改进的研究

血塞通注射液含量测定方法中有关色谱柱筛选与方法再改进的研究

苏小媛

云浮市食品药品检验所 广东省云浮市 527300

摘要：目的:通过HPLC法试验不同品牌的C18色谱柱对血塞通注射液含量测定项下人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度的测定结果影响。方法：以十八烷基硅胶键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按国家食品药品监督管理局国家药品标准WS3-B3590-2001(Z)-2011中的规定进行梯度洗脱^［1］，流速每分钟为1.5ml，检测波长为203nm，柱温25℃。人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度应大于1.5。 理论塔半数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。结果：采用6款不同品牌的C18色谱柱，分离度出现很大差异，且针对ACE和Kinex两款牌子的柱调整了0-22分钟的流动相A为18%，流动相B为82时，经过优化梯度洗脱方法，分离度明显增大，分离效果良好。 结论：本研究中血塞通注射液中含量测定项的改进方法操作简单，色谱行为良好，效果显著。可以广泛应用于血塞通注射液的质量分析检测与监测中，可为药厂的生产和检验机构的检验检测提供有价值的参考。

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关键词：高效液相色谱；色谱柱；人参皂苷Rg1;人参皂苷Re；分离度；流动相

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概述

　　血塞通注射液作为一种临床应用较为广泛的中成药，是广西中恒集团与广东雷允上药业的主打产品。其含量测定项^［2］下人参皂苷类的检验结果在原标准方法条件下得到的实验结果往往不理想，人参皂苷类测定不但耗时长，还存在着人参皂苷Rg1与人参皂苷Re难分离，分离度低的难题。为了提高该产品含量测定方法的准确性，提高检验效率，结合本所工作实际，并仔细开展了如下的实验对血塞通注射液含量标准进行研究^［3］。

1.仪器与主要试药：

1.1仪器

此次检测中使用的高效液相色谱仪为岛津高效液相色谱仪LC-20AD，本仪器主要由三元泵（A、B、C泵）、SPD-20A二极管阵列紫外可见光检测器、CTO-20AC柱温箱、CBM-20A系统控制器、DGU-20A5R在线脱气泵、SIL-20AC自动进样器、LabSolutions工作站组成。

1.2试剂

甲醇（AR,天津市富宇精细化工有限公司，≥95%）、乙腈（色谱级，默克股份有限公司，含有≤100.0%乙腈）、聚四氟乙烯微孔滤膜（25mm,0.22μm,津腾®）

1.3对照品

对照品均来自于中国食品药品检定研究院，人参皂苷Rg1（批号110703-201832，含量为92.4%）；人参皂苷Re （批号 110754-201827，含量为93.4%）；三七皂苷R1（批号110745-201619，含量为95.0%）；人参皂苷Rb1 （批号110704-201726，含量为91.1%）；人参皂苷Rd（批号111818-201603，含量为92.1%）。

1.4供试品：

药品名称：血塞通注射液；生产厂家：朗致集团万荣药业有限公司；规格：每支装20ml(含三七总皂苷400mg)；批号：17042321

2.方法与结果

2.1色谱条件

2.1.1含量测定项目：三七皂苷R1,人参皂苷Rg1, 人参皂苷Re, 人参皂苷Rb1, 和人参皂苷Rd^［4］，(按照国家食品药品监督管理局国家药品标准WS3-B3590-2001(Z)-2011及《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法试验)

2.1.2色谱条件与系统使用性试验 以十八烷基硅胶键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速每分钟为1.5ml，检测波长为203nm，柱温25℃。人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度应大于1.5。 理论塔板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

标准规定的流动相比例见表1

表1

Tab.1

2.1.3对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re 对照品、三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rb1 对照品和人参皂苷Rd对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含 5mg的混合对照溶液，即得。

2.1.4供试品溶液的制备：精密量取本品适量，用甲醇制成每1ml中约含5mg的溶液，即得。

2.1.5测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按标示量计算，含三七皂苷R1（C47H80O18）不得少于4.5%，人参皂苷Rg1(C42H72O14)不得少于18.0%），人参皂苷Re(C48H82O18)不得少于2.5%），人参皂苷Rb1(C54H92O23)不得少于24.0%，人参皂苷Rd(C48H82O18)不得少于5.0%，且五者的总量应为72.0-98.0%。）

2.1.6色谱柱：①ACE（100×4.6mm，5μm）；②Diamond（150×4.6mm，5μm）；③Inersil（150×4.6mm，5μm）；④Inersil（250×4.6mm，5μm）；⑤Kinex（100×4.6mm，5μm）；⑥资生堂（250×4.6mm，5μm）

2.2实验结果

2.2.1实验图谱：按国家局颁标准流动相进行实验，色谱柱①②③④⑤⑥的系统适用性图谱及相关数据如下：

图1 ACE（100×4.6mm，5μm）色谱柱系统适用性图谱及数据

Fig.1 ACE（100×4.6mm，5μm）Applicability atlas and data of chromatographic column system

图2 Diamond（150×4.6mm，5μm）色谱柱系统适用性图谱及数据

Fig.2 Diamond（150×4.6mm，5μm）Applicability atlas and data of chromatographic column system

图3 Inersil（150×4.6mm，5μm）色谱柱系统适用性图谱及数据

Fig.3 Inersil（150×4.6mm）Applicability atlas and data of chromatographic column system

图4 Inersil（250×4.6mm，5μm）色谱柱系统适用性图谱及数据

Fig.4 Inersil（250×4.6mm，5μm））Applicability atlas and data of chromatographic column system

图5 Kinex（100×4.6mm，5μm）色谱柱系统适用性图谱及数据

Fig.5 Kinex（100×4.6mm，5μm））Applicability atlas and data of chromatographic column system

图6资生堂（250×4.6mm，5μm）色谱柱系统适用性图谱及数据

Fig.6 Shiseido （250×4.6mm，5μm））Applicability atlas and data of chromatographic column system

2.2.2实验结果比较：

表2

Tab.2

2.2.3结果讨论：

色谱柱②五个峰不能完全分离，导致人参皂苷Rg1与人参皂苷Re重叠；

色谱柱③和④均为大品牌Inersil色谱柱，③分离度远低于标准要求1.5，而色谱柱④相比本品牌短柱分离度要高点，但分离度仍然低于标准要求1.5；

色谱柱⑥不能分离人参皂苷Rg1峰和人参皂苷Re峰；

色谱柱①和色谱柱⑤为同一生产厂家下两个不同品牌的色谱柱，色谱柱①分离度低于1.5，但峰形尚好，色谱柱⑤在标准流动相色谱条件下分离度能达到1.5，而且峰形好；

2.3色谱条件优化

2.3.1调整流动相

在2.1色谱条件基础上选择部分色谱柱（①⑤）进行实验，对国家食品药品监督管理局国家药品标准WS3-B3590-2001(Z)-2011标准规定中的流动相进行优化。

优化后流动相比例调整如下：

表3

Tab.3

2.3.2优化后实验结果

优化后，使用色谱柱①⑤分别进行实验后，其系统适用性图谱如下：

图7 ACE（100×4.6mm，5μm）优化后色谱柱系统适用性图谱及数据

Fig.7 ACE（100×4.6mm，5μm）Applicability atlas and data of optimized chromatographic column system

图8 Kinex（100×4.6mm，5μm）优化后色谱柱系统适用性图谱及数据

Fig.8 Kinex（100×4.6mm，5μm）Applicability atlas and data of optimized chromatographic column system

2.3.3优化后结果比较

色谱柱①⑤优化前后分离度结果比较

表4

Tab.4

3.结果讨论

　　优化流动相后，色谱柱①ACE（100×4.6mm）和⑤Kinex（100×4.6mm）分离效果均高于标准分离度要求1.5，优化后①的分离度达到2.060，而⑤达到2.875，远高于①，而且峰形更好了。

4. 结束语

综上所述，在HPLC法不同色谱柱对血塞通注射液中人参皂苷Rg1与人参皂苷Re分离度的影响研究中，色谱柱ACE和色谱柱Kinex柱对人参皂苷Rg1与人参皂苷Re分离度效果优于其他品牌的色谱柱，另外，在原标准实验的基础上通过减少有机相在0-22分钟内的比例，优化流动相后能取得更好地应用效果。因此，色谱柱Kinex对血塞通注射液中人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度效果最好，峰形也较好，符合药典要求，值得充分重视，适用于对人参皂苷Rg1与人参皂苷Re两组分的分离。

参考文献

1. 王梅，范亚刚，高文分.RP-HPLC梯度洗脱法同时测定三七总皂苷及血塞通注射液中三种皂苷的含量[J]《药物分析杂志》2000(020)006.

2. 代龙.HPLC法测定血塞通分散片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1的含量[J]《药学研究》2009（028）006.

3. 张玮，徐霜，韩颂.血塞通片的含量标准研究[J]《黑龙江医药》2009（028）006.

沙东旭，张满来，杨文.高效液相色谱-蒸发光散射测定血塞通注射液中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re及Rb1的含量[J]《中国药品标准》2008（009）005.刘老师15010890676广东省广州市番禺区钟村镇钟三村民委员会旁，隆辉创业公馆C座208房！