利用 Sanger测序技术对高度近视已知致病基因的突变筛查

邓妮妮 1， 黄明汉 2， 麦秋萍 1 ， 任建巧 1

1. 防城港市爱尔眼科医院，广西 防城港 538000； 2. 南宁爱尔眼科医院， 广西 南宁 530000

【摘要】目的：观察利用Sanger测序技术对高度近视已知致病基因的突变筛查分析。方法：临床选择我国高度近视汉族人群家系成员20名，连续四代均有发病，均为常染色体显性遗传。对全部家族成员进行视力检查、眼底照相、IoLmaster扫描检测眼轴长度、综合验光检测屈光度。同时选择高度近视散发病人、其他家系先证者120例和无近视症状的正常对照组300例；应用Sanger测序技术对高度近视已知致病基因突变进行筛查，评估高度近视的致病基因突变和致病机制。结果：生物信息学过滤分析在连锁分析定位的2号染色体区间出现候选变异2个:ANKRD39:c.479G>A(p.R160Q)、FERIL5：c.6235A>G(p.N2079D)；Sanger测序分析病人未携带FERIL5突变c.6235A>G(p.N2079D)，突变和疾病不共分离，该家系致病基因FERIL5排除；Sanger测序结果发现该家族全部高度近视病人及有近视症状者出现ANKRD39:c.479G>A突变，正常人未发现该突变，近视突变和表型共分离。结论：高度近视已知致病基因突变筛查发现其可能致病基因为ANKRD39基因。

【关键词】外显子组测序；ANKRD39；全基因组连锁分析；高度近视

【基金项目】爱尔眼科医院集团科研基金项目计划书(项目编号：AFQ1709D1)

Mutation Screening of Given Pathogenic Genes for High Myopia Patients Using Sanger Sequencing Technology

DENG Ni-ni¹,HUANG Ming-han²,MAI Qiu-ping¹,REN Jian-qiao¹

1.Fangchenggang Eier Eye Hospital,Fangchenggang Guangxi 538000,China;2.Nanning Eier Eye Hospital,Nanning Guagnxi 530000,China

【Abstract】Objective:To conduct the mutation screening of given pathogenic genes for high myopia patients using Sanger sequencing technology.Methods:20 fourth generations of Chinese Han population family members with high myopia were selected.The autosomal dominant inheritance was presented.Eye test,eye-ground photography and IoLmaster scanning were used to measure the ocular axial length,diopter by optometry.120 high myopia patients and other probands and 300 normal groups without myopia were selected.Sanger sequencing technology was applied for mutation screening of given pathogenic genes.Pathogenic gene mutations and pathogenic mechanism were evaluated.Results:Bioinformatics analysis indicated there were two candidate mutations in number 2 chromosome,namely,ANKRD39:c.479G>A(p.R160Q)and FERIL5:c.6235A>G(p.N2079D);Sanger sequencing analysis showed patients did not carry FERIL5 c.6235A>G(p.N2079D);mutations and disease was not co-segregated;Thus pathogenic gene FERIL5 was removed.Sanger sequencing results showed high myopia and myopia patients had ANKRD39:c.479G>A;normal groups did not have such gene mutations;gene mutation and phenotype was co-segregated.

Conclusion:The mutation screening of given pathogenic genes for high myopia patients demonstrates that ANKRD39 is considered as the potential pathogenic gene.

【Key words】exome sequencing;ANKRD39;whole-genome linkage analysis;high myopia

高度近视是指屈光度≥-6.0D或眼轴长度≥26mm，常表现为颞侧弧形斑、色素上皮变薄、豹纹状眼底、视网膜脉络膜萎缩、漆裂纹、Fuch斑等眼底特征以及伴随有青光眼、白内障、视网膜脱离等严重并发症，是导致失明的重要原因之一^[1-2]。近年来随着全外显子测序技术的发展，使得从分子水平开展高度近视的病因学研究成为可能。本研究观察利用Sanger测序技术对高度近视的已知致病基因突变进行筛查，现报道如下。

1资料和方法

1.1一般资料

临床选择我国高度近视汉族人群家系成员20名，连续四代均有发病，男女发病比率无明显差异，均为常染色体显性遗传。对全部家族成员进行A型超声波扫描检测眼轴长度、屈光、视力检查。同时选择高度近视散发病人、其他家系先证者120例和无近视症状的正常对照组300例；排除标准：Marfan综合征、Stickler综合征、合并高度近视综合征，其他原因导致的高度近视。家系内临床资料均符合高度近视的诊断标准，屈光不正≥-6.00D，双眼近视≥-6.00，伴有散光，呈进展性增高，年龄7-50岁，平均年龄(32.5±5.1)岁。

1.2方法

致病基因细胞模型的构建和基因功能的初步探索:①构建相应致病基因野生型蛋白和突变蛋白的表达载体：使用Agillent公司的Quick Change Primer Design在线工具，设计突变载体构建引物，利用Phusion高保真酶，以野生型载体为模板，构建突变型蛋白的表达质粒。②野生型和突变蛋白的降解速率及降解途径研究。细胞分别转染野生型和突变型蛋白表达载体，转染后36小时用CHX处理细胞0h、4h、8h、12h、16h和24h；上述构建的野生型和突变型稳定表达细胞系，CHX处理细胞0h、4h、8h、12h、16h和24h，抑制新的IHM1蛋白的合成。之后用western blot方法检测细胞内IHM1蛋白量，研究细胞内野生型和突变型X蛋白的降解速率及蛋白稳定性。细胞转染36小时后和野生型及突变型稳定表达细胞系，分别用溶酶体抑制剂氯喹处理细胞8小时，蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞10小时，western blot检测抑制降解途径后细胞内X蛋白的表达量。

1.3统计学处理分析

全部数据进行SPSS21.0软件系统处理分析，计数资料进行²检验，P<0.05为差异有意义。

2结果

2.1生物信息学分析

生物信息学过滤分析在连锁分析定位的2号染色体区间出现候选变异2个:ANKRD39:c.479G>A(p.R160Q)、FERIL5：c.6235A>G(p.N2079D)。

2.2家系突变筛查和共分离验证

Sanger测序分析病人未携带FERIL5突变c.6235A>G(p.N2079D)，突变和疾病不共分离，该家系致病基因FERIL5排除，见图1。

图1 家族成员FERIL5：c.6235A>G突变筛查结果 突变型为m，野生型为+，圆形为未发生FERIL5变异。

Sanger测序结果发现该家族全部高度近视病人及有近视症状者出现ANKRD39:c.479G>A突变，正常人未发现该突变，近视突变和表型共分离，见图2。

图2 家系成员:ANKRD39:c.479G>A突变筛查结果 突变型为m，野生型为+

3讨论

高度近视主要有单基因遗传的高度近视和多因子遗传的高度近视^[3-4]。单基因突变导致的高度近视，主要遵循孟德尔遗传定律，表现为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和性染色体连锁遗传，且具有很高的遗传异质性^[5]。本研究利用Sanger测序技术对高度近视已知致病基因的突变筛查发现，结果显示：Sanger测序结果发现该家族全部高度近视病人及有近视症状者出现ANKRD39:c.479G>A突变，正常人未发现该突变，近视突变和表型共分离；300例正常对照无症状重未发现:ANKRD39基因c.479G>A突变，高度近视散发或家系先证者ANKRD39的旁侧剪接位点及编码序列未筛查到突变，与杨琳等^[6]的研究结果大体一致，其可能致病基因为ANKRD39基因，含有外显子4个，长度为10.04kb，位于2q11.2，编码锚蛋白重复结构域蛋白，包括氨基酸183个，具有锚蛋白重复序列4个，可对不同蛋白家族的蛋白质间相互作用进行调节，其氨基酸序列变化可引发相互作用的蛋白无法正常发挥作用。ANKRD39基因突变c.479G>A(p.R160Q),在2号染色体的连锁区域，在第二种连锁分析方案下，连锁显著，LOD值超过3。综上所述，高度近视已知致病基因突变筛查发现其可能致病基因为ANKRD39基因。

参考文献

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收稿日期:2021年8月16日

出刊日期:2021年10月25日

引用本文:邓妮妮,黄明汉,麦秋萍,等.利用Sanger测序技术对高度近视已知致病基因的突变筛查[J].当代介入医学, 2021, 1(16) : 1-2. DOI: 10.12208/j.jcim.2021.16.082

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