甘肃省武威医学科学院 检验科 733000
摘要:目的:探究固相萃取结合液相色谱-质谱法用于人全血中地塞米松检验的临床价值。方法:2020年8月至2022年2月,医院临床收治的60例住院患者为例,对所有患者均进行人全血检查,检查方式使用固相萃取结合液相色谱-质谱法,检验中以点喷雾电离源(ESI)以及多反应监测方式(MRM)进行监测,观察人全血中地塞米松的检出限,线性范围,回收率以及精密度。结果:地塞米松最低检测限检测结果为0.04ng/ml;1ng/ml-50ng/ml线性关系较好;地塞米松回收率范围78.58%~89.58%之间,且日内精密度范围2.22%~3.84%,日间精密度范围2.23%~3.28%。结论:人全血中地塞米松检验过程中使用固相萃取结合液相色谱-质谱法具有操作简单,检出限低,回收率高等特点,值得在临床检验科推广使用。
关键词:固相萃取;液相色谱-质谱;全血;地塞米松;检验价值
地塞米松属于长效糖皮质激素类药物,该药物具有较强的抗炎作用,免疫抑制作用,抗毒素作用,抗休克作用,影响造血系统,中枢兴奋作用,由于具备上述特点,该药物被广泛应用于临床患者疾病治疗中[1-2]。作为泼尼松龙的氟化盐生物,地塞米松的半衰期为36-54h,由于不同患者生理机能不同,因此在药物应用过程中其适应症存在不同,患者极容易在药物应用过程中出现过敏反应,进而导致自身机体代谢出现异常,如果儿童应用该药物进行治疗很容易导致儿童生长出现异常[3-4]。这种情况下需要积极加大针对地赛米松全血中的检验研究。常见地塞米松检验方法主要有高效液相色谱质谱联用方法,紫外线分光光度法以及气相色谱-质谱法等,这些方法均可以在一定程度上对全血中地塞米松进行检验,但是由于这些检验方法的灵敏度特异性以及检出限较高,进而影响临床地塞米松检验效率[5-6]。研究发现固相萃取结合液相色谱-质谱法在人全血地塞米松检验具有良好效果,基于此,研究中纳入60例住院患者(时间2020年8月至2022年2月)探究固相萃取结合液相色谱-质谱法地塞米松检验价值。
材料与方法
1.1仪器与试剂
实验中使用仪器及试剂如表1。
表1实验中使用仪器及试剂
实验仪器 | Shimadzu LC-30A高效液相色谱系统及化学工作站 |
AB Sciex5500液质联用仪(金财鑫科技有限公司) | |
ACQUITY UPLC ®HSS T3色 谱 柱(50 mm×2.1mm,1.7μm,Waters) | |
Oasis®HLB固相萃取小柱(3cc,60mg,Waters) | |
Millipore 纯水仪(上海湛仪智能科技有限公司) | |
实验试剂 | 99.9%地塞米松标准品(上海远慕生物科技有限公司) |
乙腈、甲醇和甲酸(色谱纯,Fisher) | |
去离子水(Milipore) | |
空白人全血样品(医院) |
1.2试剂配制
实验过程中对地塞米松进行精密称取,称取样品量10.0mg,将10.0mg地塞米松放置到容量瓶中,容量瓶容量为10ml,向容量瓶中添加甲醇溶液,将地塞米松进行稀释,获得地塞米松储备液1.0mg/ml,将地塞米松储备液放置在环境为4℃环境中进行保存备用。并且依据实验过程中的相关需求,需要针对储备液再利用甲醇进行针对性稀释,直到地塞米松储备液稀释到实验需要浓度。
1.3样品处理
实验前,选取人全血样品1.0ml,将其放置在容量10ml的试管中,而后将全血样品放置在温度4℃环境中,采取离心处理操作,操作过程中具体数据控制在离心速度8000r/min,离心时间控制在10min,完成上部分离心操作后,将样本上层血清进行提取,留以备用。接下来进行活化HLB固相萃取柱,活化条件为先利用甲醇进行处理,甲醇量控制在3ml,完成甲醇处理后,利用清水进行活化,清水量控制在3ml。将上述实验中离心后的血清上层溶液接触固相萃取柱,保证液体流过柱体速度控制在3ml/min,完成该项操作后使用纯水进行固相萃取柱淋洗,淋水量为3ml。完成淋洗操作后,利用真空泵将小柱内部的剩余溶液抽干,而后在对其进行甲醇洗脱,洗脱过程中甲醇量控制在3ml,利用0.22μm有机过滤膜进行洗脱液过滤,完成这部分操作后进行样本检验。
1.4仪器分析
色谱条件:流动相为0.1%甲酸以及乙腈溶液,柱温:25℃,流速:0.4ml/min,洗脱方式:梯度洗脱。0~1.0min:乙腈由10%升至90%;1.0~2.0min:乙腈溶液保持90%不变,2.0~2.1min,乙腈由90%降至10%,乙腈10%数据保持2min,进样量:3μL。
质谱条件:电喷雾电离源(ESI);离子源温度:600℃;电喷雾电压:5500V;脱溶剂气:70psi;锥孔气:8psi。在实验过程中其扫描:多反应监测方式(MRM);离子对:393.1/355.1和393.1/237.0。
结果
2.1线性相关性分析
将地塞米松储备液添加到1.0ml空白全血中,制成不同地塞米松浓度溶液,分别为1.0ng/ml,5.0ng/ml,10.0ng/ml,50.0ng/ml等样品,使用固相萃取结合液相色谱-质谱法进行检验,每个样本溶液检验次数为3次,以地塞米松的峰值面积以及标准浓度,分别为Y与X,对两者之间的线性相关性进行分析,获得线性回归方程Y=195 40X-48 784,r2=0.984 3,而且实验中发现当地塞米溶液浓度处于1ng/ml-50ng/ml浓度范围内,其线性关系较好。
2.2回收率分析
回收率研究中取3分全血均为1.0ml,向其中加入地塞米松储备液,将溶液配制成100ng/mg,50ng/ml,5ng/ml的样品浓度溶液,利用此次检验方法进行测定,测定频率为3次/d,连续3d,对其日内精密度以及日间精密度和回收率进行测定,测定结果如表2。
表2日内以及日间精密度和回收率情况(%)
地塞米松浓度 | 5ng/mL | 50ng/mL | 100ng/mL |
日内精密度 | 3.24% | 3.84% | 2.22% |
日间精密度 | 3.28% | 5.55% | 2.23% |
回收率 | 78.58% | 84.17% | 89.58% |
通过研究发现,利用该种检验方法人全血中地塞米松回收率范围78.58%~89.58%之间,且日内精密度范围2.22%~3.84%,日间精密度范围2.23%~3.28%。
2.3检出限分析
抽取地塞米松储备液,将其使用流动相进行稀释,稀释一定程度后利用信噪比S/N≥10为最低定量限测的结果为0.1ng/ml,以信噪比S/N≥3进行最低检测限,检测结果为0.04ng/ml。
讨论
现阶段地塞米松药物已经被世界卫生组织列入基本药物标准清单之中属于基础公共体系之一[7]。该药物作为一种人工合成的皮质类固醇,目前被广泛应用于临床疾病治疗中,可以对多种症状进行缓解,例如风湿性疾病,皮肤性疾病,严重过敏,哮喘,慢性阻塞性肺疾病,脑水肿等,也可以与抗生素进行联合应用治疗与结核病,这种情况充分说明了该药物的广泛性,通过其抗炎抗过敏帮助患者改善病症[8-9]。但与此同时,如果药物应用不当,同样会造成患者出现过敏反应,轻度影响患者病症改善,重度则会造成患者出现过敏性休克症状。该药物的化学结构和泼尼松龙的B环9α位置引入氟原子,地塞米松和泼尼松龙的生物等效应0.75:5,其生物半衰期36-54h,属于长效糖皮质激素[10-11]。
为保证药物用药安全,需积极加强针对人全血中地塞米松的检验方法研究。临床中常用的检验方法主要为高效液相色谱质谱法以及紫外分光光度法。该种检验方法通常需要使用甲醇溶液进行溶解,而后利用流动相稀释,通过高效液相色谱仪进行色谱分离,而后采取紫外线吸收检测,检测过程中波长选择240nm利用该种方法进行检测同样可以针对地塞米松进行检验[12-13]。随着检验技术的逐渐优化,固相萃取结合液相色谱-质谱法被广泛应用到临床人全血地塞米松检验中。固相萃取属于样品预处理技术,通常被用于样品的分离,纯化和浓缩,具有较高的回收率[14]。分析此次研究结果发现地塞米溶液浓度处于1ng/ml-50ng/ml浓度范围内,其线性关系较好。利用该种检验方法人全血中地塞米松回收率范围78.58%~89.58%之间,且日内精密度范围2.22%~3.84%,日间精密度范围2.23%~3.28%。具有较高的日间夜间精密度,同时回收率也较高,这种情况说明实验室检验效果较好,检验回收率较高,检验更加便捷与安全。使用流动相进行稀释,利用信噪比S/N≥10为最低定量限为0.1ng/ml,以信噪比S/N≥3最低检测限为0.04ng/ml,说明该种检测方法检测线较低,抗干扰性强,而且检验过程中具有较高的稳定性且保留效果并不出现拖尾情况,具有较高的分离效果。同时研究过程操作简单,检验方法较为快速,能够在短时间内实现地塞米松检验。除了应用与临床地塞米松检验外,固相萃取结合液相色谱-质谱法还可以被应用于其他检验领域,例如食物安全,农药残留等[15]。
综上所述,地塞米松检验是临床重要的检验内容之一,对于保证患者身体健康以及提升患者生活质量,实现患者身体康复有积极意义。固相萃取结合液相色谱-质谱法具有安全性高,分离效果好,操作简单便捷,重复性强,检测限低,回收率高等特点,值得在临床人全血地塞米松检验中推广使用。
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