免疫学检验技术应用的研究进展

免疫学检验技术应用的研究进展

杜开丽

四川省平昌县第二人民医院 四川巴中 636400

【摘要】现代免疫学技术广泛运用于医疗机构的检验中，文中从荧光素标记的免疫测定，酶标记免疫测定等方面，探索了免疫学检验技术应用的研究进展情况，旨在为免疫学检验技术的应用提供技术参考。

【主题词】医学检验；免疫学；技术应用；研究；进展

现代免疫学起源于标签技术的开发。1941年Coons等人创建了荧光素标记抗体技术之后，Yalaw等人在1950年代后期到1960年代初期确立了放射免疫分析技术^[1]。1966年,法国和美国学者同时又报告了酶免疫测定法。另一种传统的标记技术是胶体金标免疫，发展于20世纪80年代，除了免疫电子显微镜检查的应用外，免疫过滤和免疫层析试验也被广泛使用。此外，科学家还发现了一些新的标记免疫技术，如元素标记、核酸标记、量子点标记免疫测定技术等。从这些技术中衍生出来的实验方法，有些已被广泛应用于临床免疫学检查，而有些仍处于研究和探索阶段^[2]。本文主要对免疫学检验技术的应用以及研究进展做综述，报告过程与结果如下：

1 荧光素标记的免疫测定技术

1.1 间接免疫荧光技术（IFA）。 此技术作为细胞内抗原定位和对应抗体检测的“金标准”，从很早以前就开始使用，适用于筛选实验，主要使用抗核抗体(ANA)、抗ds-DNA抗体、抗平滑肌抗体。(AS-MA)和抗平滑肌抗体(AS-MA)。检测自身抗体(如中性粒细胞细胞质抗体)和特定病原体(EB病毒、SARS病毒、军团菌、其他呼吸道病原体)的抗体。完全自动的操作系统已经商品化了。其技术特点是减少手动操作可能引起的偶发错误，改善免疫测试的标准化和自动化，减少实验所需要的时间。

1.2 流式细胞免疫荧光分析（FCM）技术。该技术借鉴荧光抗体和血细胞分析装置的原理,并利用相对细胞数从绝对数量从膜组成,细胞组成,细胞内单色荧光到多色荧光的开发经验,并免疫分子表达型过程和统合分析型表达的组合,是为细胞分析和筛选的最重要的工具。在细胞表型分析、DNA含量和细胞周期分析、细胞内和核膜组成分析和细胞分选等领域中有着非常广泛的用途。

1.3 以荧光素标记为基础的四聚体分析技术。该技术主要是基于MHC /抗原肽复合物和T细胞表面受体(TCR)之间相互作用的原理而形成。首先，选择能被抗原特异性T细胞识别的表位肽和与表位肽结合的HLA。形成HLA-肽复合物的分子。进一步生物素化后以特定的比例与用特定的荧光素(PE等)标记的链霉亲合素进行混合^[3]。这样构筑的四聚体能够通过自身的MHC分子提取物中的表位肽为了达到准确检测抗原特异性细胞的目的，在T细胞表面鉴定TCR，并进行组合。由此而来的技术的主要类型如下。(1) MHC-肽四聚体流式细胞术的特点是迅速、高灵敏度、特异性，无论这些细胞是原始的还是具有效应、功能或非功能性都可以对所有抗原特异性T细胞进行计；(2) 原位MHC-肽四聚体染色法(IST)。分为直接法和间接法，用于组织切片的染色，以及检测抗原特异性T细胞的空间和时间的分布；(3) MHC-肽四聚体磁分离磁技术，分离出抗原特异性T细胞可以用于对其的生物学功能进一步分析；(4) MHC-肽四聚体ELISA法；(5) MHC-肽四聚体分子微阵列技术。上述基于荧光素标记的基础四聚体分析技术适用于病毒(HBV, HCV, HIV等)抗原，肿瘤抗原特异性T细胞，以及与自身免疫性疾病(ART)相关的自身反应性T细胞（ART）的测定与研究中。

2 酶标记免疫测定技术（EIA）

2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）技术。理论上，只要得到特定抗原或对应抗体制剂的纯产物，对应抗体或抗原就能够进行ELISA的测定。因此，几乎所有的可溶抗原和抗体系统都可以用这个技术来检测。其特征是实验结果具有较高的灵敏度和特异性，最小的测定值有可能达到ng或pg的水平，但也容易受到诸多因素（如包被抗原、抗体质量、微孔板表面吸附性能程度等）的干扰。与放射免疫分析技术比较，ELISA技术的优点是标记试剂比较稳定，没有放射性危险，在血源病原体(抗原和抗体)、体液中的各种微量蛋白质(肿瘤标志物、细胞因子、小分子激素、自身抗体、特定药物和药物等)中有广泛的用途。除了手动操作之外，现在有自动化的酶(开放式和封闭式)系统，可以根据需要选择合适的试剂，也可以在仪器中配套的试剂中进行使用。

2.2 以酶标记为基础的免疫印迹和免疫斑点技术。虽然免疫印迹和免疫斑点测量密切相关，但却是两种不同的分析方法。前者是利用SDS-PAGE分离组织、细胞或细菌溶解物的蛋白质成分，并将其转录到硝基纤维素(NC)膜上进行分析。后者是将纯化或基因重组后的蛋白质抗原在NC膜表面以点或线性形式直接固相化。之后与样品的反应，酶结合抗体，以及颜色渲染的过程是完全一样的

^[4]。由于实验使用蛋白质亚单位或纯抗原分子，这项技术可以用于特定抗原或抗体，例如HIV和HCV感染的诊断测试，抗核抗体的ENA多肽抗体保留物、特定过敏原(IgE靶抗原)和其他项目。除定性检查外，还可以在实验中扫描色带或光斑，报告定量测量结果。

2.3 酶联免疫斑点技术（ELIs-pot）技术。ELIspot是为了测定分泌免疫球蛋白的B细胞和分泌细胞因子以及T细胞的功能而基于ELISA方法开发的分析技术。定量ELISA技术的延伸以及发展。该方法原理和实验计划是在微孔培养板底部针对特定的ig或CK涂覆特定的单克隆抗体。将测试的外周血单核细胞(PBMC)加入到微型孔板中进行培养。在特定抗原和胺基酸的作用下，记忆型B细胞和T细胞在数小时内被激活，分泌Ig和CK。位于细胞下方的固相单克隆抗体捕获。细胞被洗去后，被捕获的Ig或细胞因子与接下来加入的生物合成抗体结合，接着加入酶标记亲合素与生物素反应，使酶基质显色，阳性细胞就会在固相板的底部形成了直径约50 ~ 200φm的圆形着色斑点。每个点对应一个分泌Ig或CK的细胞，斑点的直径直接反映特定阳性B和T细胞内群体的产能。

该技术除了对分泌抗体的B细胞进行初期检测外，还用于检测T细胞分泌的各种CK情况，因此ELIspot成为免疫学研究中测定T细胞功能的标准技术。其优点是提供了接近体内的实验环境，在几乎自然的生理学条件下，可以观察单个细胞分泌免疫学活性物质的过程。能以百万分之一的频率检测出阳性细胞。这种检测分辨率通过四聚体染色和ELISA法的测定远远超过了细胞内细胞的灵敏度。因为该种技术会受到更多因素的干扰，所以需要更严密的实验操作。包括抗体包被、清洗、添加活性剂(特定抗原肽等)、细胞的接种和培养，这些都需要严格灭菌。细胞培养过程中应避免移动，减少碰撞、开关培养箱的次数，否则会引起细胞位移，引起模糊的斑点和变形。同时，有更多重复孔，需要设置阳性、阴性和空白对照。为了进一步实现不同实验者以及实验室中测定结果的可比较性，还需要定量的质量管理系统。以核心实验室的质量控制细胞作为质控品，对该实验室中的测定结果进行质量检验。

3 结语

实验中使用抗原体系中,过去从组织或细胞溶解物提取的抗原基因工程抗原逐渐变化，从单一病原体蛋白质多决策融合性蛋白转变，并发现了重组抗原不包括极少数非特异性抗原，可以设计和表达针对特定目标蛋白质的特异性多肽类抗原片段；在抗体系统中，从多克隆和单克隆抗体转变为基因改造的抗体和双功能性抗体。基因重组供给和小型化单链可变区(VH和VL)片段(scFv)抗体。检测系统还实现了自动化、集成和小型化(如蛋白质芯片和免疫传感器的应用。这一发展趋势有助于实验操作的标准化和规范化，提高实验结果的准确性和可重复性，促进实验室之间测试结果的互认。

参考文献

[1]戴随.免疫学检验技术的研究进展[J].首都食品与医药, 2021, 28(2):2.

[2]戴随.免疫学检验技术的研究进展[J]. 首都食品与医药, 2021, 28(2):2.

[3]李燕琼.免疫学快速检验技术的应用与进展[J].中国实用医药,2014,9(01):261-262.

[4]王蒴,王信惠,黎唯.鼠疫免疫学检测技术的应用和研究进展[J].中国媒介生物学及控制杂志,2019(2):4.