培养条件下有毒硅藻的毒素代谢变化

培养条件下有毒硅藻的毒素代谢变化

姜珊珊 1-2 ，李磊 2，张中义 2

1.山东半岛卤水资源高值化绿色综合利用工程技术研发中心 ,潍坊科技学院

2.农学与环境学院，潍坊科技学院

摘要

有毒硅藻拟菱形藻属是全球记忆缺失性贝毒的主要产毒生物,并且是引发赤潮的重要种类，它产生的软骨藻酸经贝类等海洋生物摄入进入食物链，对水产养殖业和人类健康安全产生很大的危害。但是我国关于记忆性丧失贝毒的相关研究还鲜有报道，为了探究其生长状况及产毒特征，本实验通过对山东省莱州湾的拟菱形藻培养系的建立，利用高效液相色谱法（HPLC）检测软骨藻酸毒量的变化，再分析藻类产生的软骨藻酸在培养体系中毒素的蓄积代谢情况，实验成果可为有毒微藻类的应用提供重要的参考意义。

关键词：软骨藻酸；拟菱形藻；毒素；高效液相色谱

引言

软骨藻酸(domoic acid，DA)，是一种天然神经毒性氨基酸，最初发现是由在加拿大东海岸形成赤潮的一种硅藻属多列尖刺拟菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens forma multiseries)产生，而贝类经由过程滤食有毒硅藻，将软骨藻酸富积在体内。人类因食用被软骨藻酸污染的贝类而中毒^[1-2]。此后，在加拿大、美国海岸，拟菱形藻赤潮产生软骨藻酸而引起危害的事件不断被报道^[3]。

虽然目前尚无关于中国海域拟菱形藻产生软骨藻酸的直接相关报道,但有报告我国渤海等海域部分海产品中检测到低浓度的软骨藻酸^[4], 有报道称大连海域的扇贝受到了软骨藻酸的污染，这提示我国海区的拟菱形藻有可能产生软骨藻酸^[5]。有报告称硅藻自然株跟培养株的产毒量不同，而且毒素在贝类体内也会发生复杂的转化^[5-7]。本实验以我国高盐度海区莱州湾的拟菱形藻为研究对象，通过HPLC检测分析藻体的天然株与培养株毒量代谢的变化，阐明藻体的毒理机制。

1实验方法

1.1有毒硅藻的毒素提取

将藻体置于15毫升的离心管中，加入10毫升0.1mol/L的盐酸振荡，然后用均质机均质，将均质后的试液放入恒温水浴锅中（100℃沸水）加热5分钟，然后用冰水冷却，冷却至室温后，用高速离心机离心（20000 g，15min），得到上清液，然后将上清液再次用离心管离心分离，用0.45um微孔有机滤膜过滤，最后用水定容到10毫升。准确吸取1.00mL试液至超滤离心管中离心，供HPLC分析测定。

1.2 HPLC检测

（1）HPLC系统：waters alliance 2690 separation module

（2）色谱柱型号：LiChroCART Superspher RP-18(e) (4.6x250mm,Cica-Reagent)色谱柱

（3）柱温：35℃

（4）流动相：流速0.8mL/min

（5）流速：0.4ml/min

（6）试剂：50mmol/L的高碘酸 0.2mol/L的KOH含1mol/l的甲酸铵，50%的甲酰胺

（7）反应器：设备型号SHIMADZU CRB—6A，柱后衍生温度65℃，1.5min

（8）检测器：waters 474扫描荧光检测器,发射波长392nm,激发波长336nm。

2实验结果

2.1 DA检量线

如图1所示，利用HPLC注入软骨藻酸标准品，得到DA检量线。

2.2. 软骨藻酸的色谱图

如图2所示，DA标准品的色谱图，显示软骨藻酸是在分析时间7分钟出现了峰值，得到峰面积，计算出毒素浓度。

图2 DA标准品色谱图

2.3. 软骨藻酸的含量比较

如图3所示，显示藻体天然株毒素含量672fmol/cell,远远高于第一代和第二代培养株。

图3 天然株与培养株的毒量对比

4结论

由实验结果得出拟菱形藻在实验室培养条件下的产毒能力与其在自然海区的产毒能力存在着差别，实验室培养条件可能会抑制其产生软骨藻酸,拟菱形藻的产毒能力是一个比较复杂的情况，,随着培养的时间越长, 产毒能力越低，最终有可能会导致死亡，本实验开展藻体毒素含量的测定，阐明藻体产毒机制，对软骨藻酸的研究不仅可以为我国近海海洋微生物生态学的深入研究提供基础性资料,更重要的是能为食品安全的保障提供科学参考。

参考文献

1. Bates, S.S., Bird, C.J., De Freitas, A.S.W., Foxall, R.A., Gilgan, M., Hanic, L.A., Johnson, G.R., Mc Culloch, A.W., Odense, P., Pocklington, R., Quilliam, M.A., Sim, P.G., Smith, J.C., Subba Rao, D.V., Todd, E.C.D., Walter, J.A., Wright, J.L.C., 1989. Pennate diatom Nitschia pungens as the primary source of domoic acid, a toxin in shellfish from eastern P.E.I. Can. J. Aquat. Sci. 46, 1203–1215.

2. Wright, J.L.C., Boyd, R.K., De Freitas, A.S.W., Falk, M., Foxall, R.A., Jamieson, W.D., Laycock, M.V., Walter, J.A., 1989. Identification of domoic acid, a neuroexcitatory amino acid, in toxic mussels from eastern P.E.I. Can. J. Chem. 67, 481–490. 

3. Teitelbaum, J.S., Zatorre, R.J., Carpenter, S., Gendron, D., Evans, A.C., Gjedde, A., Cashman, N.R., 1990. Neurologic sequelae of domoic acid intoxication due to the ingestion of contaminated mussels. New Eng. J. Medi. 322, 1781–1787.

4. 陈西平, 刘江. 水生态环境中神经毒性生物毒素——软骨藻酸[J].国外医学卫生学分册, 2001, 8(2): 92-95.

5. 李大志, 祝文君, 宋文斌, 等.记忆缺失性贝类毒素的主要成分—软骨藻酸的毛细管电泳分析[J] .色谱, 2002, 20(2):125-128.

6. 邢小丽, 杨军霞, 康燕玉, 高亚辉，梁君荣, 林旭吟。大亚湾水域两种拟菱形藻的形态学鉴定及毒素分析[J]。台湾海峡，2007, 26(4):576-582.

7. 陈西平, 刘江. 水生态环境中神经毒性生物毒素——软骨藻酸[J].国外医学卫生学分册, 2001, 8(2): 92-95.

本文是在潍坊科技学院山东半岛卤水资源高值化绿色化综合利用工程技术研发中心平台（项目编号2018LS019）支持下完成的。