人凝血因子Ⅸ的基因克隆及其在HEK293细胞中的表达

人凝血因子Ⅸ的基因克隆及其在 HEK293细胞中的表达

朱融青

加利福尼亚大学戴维斯分校  95616

摘要：

血友病B是由于凝血因子Ⅸ（FⅨ）基因缺陷所致的一种严重的遗传性出血性疾病。凝血因子Ⅸ（简称Ⅸ因子）是人体内凝血系统的重要成分之一，它的缺乏或功能缺陷可导致血友病B的发生。利用基因转移技术可能是进行遗传病基因治疗的主要研究方向。本研究主要在HEK293细胞中表达人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor，hFⅨ）蛋白。通过PCR扩增克隆该基因，以及利用脂质体将表达载体pcDNA Oripure-hFIX转入HEK293细胞，采用报告基因GFP方法检测细胞上清中hFⅨ的表达情况。本研究成功在HEK293细胞中瞬时表达hFⅨ蛋白，为进一步深入研究hFⅨ的生物学特性奠定了基础。

引言：

血友病B（hemophilia B）是人凝血IX因子（human clotting factor IX, hFIX）缺乏所引起的一种严重凝血功能障碍性疾病。编码hFIX的基因（hFIX）位于人X染色体长臂远端,被定位于Xq27. 1区域,全长34 kb,由8个外显子和7个内含子组成,cDNA全长2802bp,编码区1383bp。该病临床表现为自发性出血,严重者可导致关节变形或残疾。血友病B严重威胁着人类健康,为X染色体隐性遗传疾病,在男性中的发病率为三万分之一。血友病不仅给患者带来身体和精神上的痛苦，也使之承受着沉重的经济负担。人们设想用基因治疗的方法来替代目前常规治疗方法。因此，开辟新的凝血因子的来源对临床治疗血友病有着极其重要的意义。用基因工程的手段来生产凝血因子是首选的方法。

本实验主要包括通过PCR方法克隆扩增了人凝血因子Ⅸ基因，并顺序定向克隆于真核表达质粒Plasmid pcDNAOripure-hFIX的多克隆位点。经限制性酶切片段分析及DNA序列测序验证，证明所构建载体结构正确，然后将构建的表达载体通过脂质体染法导入HEK293细胞，经筛选后获得稳定的转基因细胞，提取细胞基因组DNA进行PCR鉴定，确定所转染的HEK293细胞内含有转入目的基因的阳性细胞。本实验所获得的转基因细胞为进一步在细胞水平检测外源基因的表达，及为通过体细胞核移植方法获得乳腺特异性表达人凝血因子Ⅸ奠定了实验基础。

1 材料和方法

1.1 质粒菌株及细胞

pUC19、pCAGGS-IRES、pEE12.4 和 pcDNAOri⁃pure-hFIX质粒本研究室保存，E.coli DH5α和HEK293细胞本研究室保存。

1.2 主要试剂及仪器

TRIzol Reagent、T4连接酶、限制性内切酶和质粒小量提取试剂盒购自天根生化试剂公司：lipofectin2000脂质体购自 invitrogen 公司：细胞培养基 DMEM 购自美国Gibco公司：常规生化试剂购自上海生物工程有限公司。引物和 DNA 测序由上海生物工程有限公司完成。使用仪器有 Bio-Rad C1000 Touch PCR 仪、Tanon2500 凝胶成像系统、NANODROP 2000c 超微量分光光度计、BIO-RAD 电泳分析仪。hFIX特异的引物，上游引物序列为5’－GCAGAATCACCAGGCCTCATCACC－3’；下游引物序列为5’－CCAAAGGGACACCAACATTCATAGGA－3’。

1.3 hFIX基因的克隆和鉴定：

用Trizol 试剂提取细胞总RNA。以总RNA 为模版，采用Oligo（dT）为引物，按照反转录试剂盒使用说明合成cDNA第一链。以cDNA为模板，分别 PCR 扩增hFIX PCR 产物用0.8 %琼脂糖凝胶电泳，胶回收。逆转录条件为42℃60min，99℃15min，4℃5min。PCR扩增条件为94℃预变性10min，进入下述循环：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，30个循环后，72℃延伸10min；PCR 产物跑胶。

将胶回收基因片段与载体 pUC19 连接，转入 E.coli DH5α感受态细胞中，37 ℃过夜培养，小量提取重组质粒，酶切和测序鉴定。PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃反应30 s、60℃反应 30s、72℃反应2min，循化30次，72℃延伸反应10 min。

1.4 重组表达质粒pCAE-GFP-hFIX的构建

HindⅢ和EcoRⅠ分别双酶切pcDNA Oripure-hFIX和pEE12.4质粒，回收hFIX片段。利用T4连接酶将回收的目的片段与同样经双酶切的pEE12.4质粒连接，连接产物转化 E.coli DH5α 感受态细胞，筛选重组质粒pEE12.4-hFIX并酶切测序鉴定。

1.5 重组质粒转染细胞HEK293

无内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒 pCAE-GFP-hFIX，并用超微量分光光度计检测纯度。用DMEM培养基在24孔培养板中培养HEK293细胞，当细胞处于对数期并汇合度为90 %以上时，将lipo⁃fectin2000 脂质体和质粒复合体滴加入培养孔中，37 ℃、CO2的体积浓度为5%的培养箱中孵育6 h～8 h，去除含有复合体的培养基，更换新的培养基，72 h后收集细胞上清。同时空载体转染HEK293细胞作为阴性对照。

1.6 hFIX基因表达的鉴定：

收集转染后72h的HEK293细胞，Trizol试剂提取细胞总RNA，RT－PCR和GFP检测hFIX mRNA 的转录。

2 研究结果：

2.1 hFIX基因克隆及鉴定

PCR 扩增获得的hFIX基因片段经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测可看见在650 bp位置附近分别有一条特异性的条带（见图2-1），与理论值一致。测序后基因序列与GeneBank比对，序列正确。

图2-1 hFIX基因PCR电泳

2.2 转化表达载体构建

为检测我们的载体是否构建成功，连接产物经转化扩增后小量提取重组质粒，我们使用目的片段上特有的HindⅢ和EcoRⅠ双酶切重组质粒， 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，可看见2个DNA片段（大小约为4 kb和3.5kb）（图2-2，line 1、line 2和line 3），电泳结果和预期值相符，因此，证明重组载体构建成功。

图2-2 HindⅢ和EcoRⅠ分别双酶切pcDNA Oripure-hFIX；载体酶切验证，line 1、line 2和line 3分别为pcDNA Oripure-hFIX载体对应的HindⅢ和EcoRⅠ双酶切结果。

2.3 人凝血因子hFIX在HEK293细胞中的表达与检测

为验证重组表达载体pcDNA Oripure-hFIX（含有eGFP报告基因）在HEK293细胞中瞬时表达，转化72小时后，激光共聚焦显微镜下观察结果表明：含有pcDNA Oripure-hFIX重组质粒在细胞核中能观察到eGFP的表达（图2-3），说明构建的pcDNA Oripure-hFIX表达载体都能在HEK293中稳定工作。

图2-3 重组表达载体侵染HEK293中eGFP表达分析；72小时后，激光共聚焦显微镜下观察eGFP表达结果。

3讨论：

血友病B为一种单基因隐性遗传性疾病，男性多发病，研究表明血友病发病率约为1/25 000，目前的治疗方法主要以替代治疗为主然而，替代治疗具有一个非常常见的问题，即hFIX因子半衰期约为 24 h，随着时间的延长，药物浓度逐渐降低，无法持久维持在有效血药浓度。并且随着给药频率的增加，也将增加患者体内hFIX抗体即抑制物的发生率。这种抑制物的产生则会使之后的凝血因子输注达不到预期效果。传统的人凝血因子产品是经分离人血浆获得，不仅成本高、价格贵，而且容易传播血源性疾病如乙肝和艾滋病等。本文在HEK293系统中成功地表达并分泌了人凝血因子hFIX，这表明这种蛋白的基因工程产业化有重要意义。。本实验所获得的转基因细胞为进一步在细胞水平检测外源基因的表达，及为通过体细胞核移植方法获得乳腺特异性表达人凝血因子Ⅸ奠定了实验基础。

4 参考文献：

1. Nathwani AC; Davidoff AM; Hanawa H; et al∙Sustained high－level expression of human factor IX （hFIX） after livertargeted delivery of recombinant adeno－associated virus encoding the hFIX gene in rhesus macaques［J］．Blood 2002 100（5）：1662－1669

2. Christopher E Walsh MD．Gene therapy Progress and Prospects：Gene therapy for the hemophiliac ［J］．Gene therapy; 2003;10（12）999－1003;

3. Manno CS; Chew AJ; Hutchison S;et al．AAV mediated factor IX gene transfer to skeletal muscle in patients with severe hemophilia B ［J］．Blood; 2003;101：2963－2972

4. Johnson PR．Hemophilia and gene transfer：this dog might hunt ［J］．Blood; 2005;105：3391

5. Krebsbach PH; Zhang K; Malik AK; et al．Bone marrow stromal cells as a genetic platform for systemic delivery of therapeutic proteins in vivo：human factor IX model［J］．J Gene Med; 2003; 5（1）：11－17