比色法测定液相混合时间及其在体外诊断试剂生产中的应用

比色法测定液相混合时间及其在体外诊断试剂生产中的应用

罗帅 1 林克萌 2 吴娜 3

1 身份证号码： 37021419900330****

2身份证号码：37028219930407****

3身份证号码： 37092119871126****

摘要：体外诊断试剂（In-VitroDiagnostic，简称IVD）的生产中，溶液均质化是关键工艺步骤，决定试剂混合的均匀程度，并最终影响试剂的性能。一般而言，混合时间定义为在混合容器中加入示踪剂并达到一定均匀程度的时间[1]，工业通常使用95%均匀度记录混合时间。Gabriel统计了近50年来的混合时间测定方法，大致上分为侵入式方法和非侵入式方法，这两类方法各自都有局限性，因此应当探索一种更为理想的混合时间测定方法，该方法应当既不影响流场状态，又可用于非透明、体积较大的工业罐体，重复性好，测定终点易于判断。
关键词：色比法；液相混合时间；体外诊断试剂

引言

由于在IVD实际生产中主要使用水样介质，因此应用水溶液检查搅拌容器的混合性能。考虑在非侵入式方法中，寻找加强的颜色变化反应，使其可以应用到非透明的反应器中。比色法是确定混合时间的常用视觉方法，与使用传感器进行局部测量相反，可以直观显示整个容器内容物的均质特性。本研究拟建立一种更适用于工业规模的混合时间测定方法，并利用该法探索对于混合时间有影响的因素，测试现有搅拌设备的性能并优化混合工艺。

1材料与方法

1.1材料与仪器

碘、碘化钾、淀粉和五水合硫代硫酸钠均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产；去离子水为罗氏诊断产品（苏州）有限公司生产。

500mL、1000mL量筒，500mL、1000mL、5L烧杯，10mL滴定管，VMR；5L不锈钢锅、C21-WT2112T电磁炉，美的；RCTbasicpackage1电磁搅拌器，IKA；5mL移液器，Eppendorf；2~8℃冰箱，MMM；Touchcontrol900pH计，MettlerToledo；Touchcontrol900电导率仪，MettlerToledo；MinebeaIntecMaxxis5电子天平，Sartorius。

1.2溶液配制

1%淀粉溶液配制：10g淀粉溶于200mL去离子水中，搅拌均匀并倒入800mL煮沸的去离子水中，煮沸后保持5min并搅拌。淀粉溶液应当新鲜配制。

1LI2-KI溶液配制：称取250g碘化钾加入500g去离子水配制碘化钾溶液至完全溶解，再加入128g碘单质混合至完全溶解，最后加入去离子水至1L并混合5min以上。

1L硫代硫酸钠溶液配制：将248g五水合硫代硫酸钠直接加入500g去离子水中，加水至1L混合至完全溶解。

I2-KI溶液和硫代硫酸钠溶液应在2~8℃下避光保存。溶液配制无须精确使用容量瓶定容，且工业罐体测试所用溶液量较大，通常使用地磅或者天平称重，关键参数为I2-KI溶液和硫代硫酸钠溶液的滴定系数T，需要准确测定。

1.3比色法测定混合时间

在搅拌设备中加入体积为V的去离子水和体积为0.0050V的淀粉溶液（VS），100r/min以上混合5min；加入体积为0.0004V的I2-KI溶液（VI），100r/min以上混合5min；加入适量Na2S2O3溶液（VN），并在完全加入后记录时间t0，一旦颜色在整个容器中消失，就停止测试并记录时间t1。

1.4数据分析方法

采用Minitab18.1统计学软件处理数据，计量资料进行正态性检验，采用均数±标准差表示，进行正态性检验，P＞0.05符合正态分布；3组数据进行Bartlett等方差检验，P＞0.05方差齐性；3组数据进行方差分析的单因子方差分析，P＞0.05说明统计学上5min、15min、30min混合质量无显著差异。

2结果与分析

2.1比色法准确性和耐受性

相对I2-KI体积过量2.5%的硫代硫酸钠是可行的，硫代硫酸钠体积不足会导致溶液不褪色，体积过量会导致溶液褪色所得的混合时间与基准方法误差增大。如硫代硫酸钠体积过量较多，过高的浓度导致硫代硫酸钠快速在溶液体系中消耗掉大部分碘单质导致褪色，而此时过量的硫代硫酸钠尚未在搅拌作用下分散均匀，会导致测定的混合时间与基准方法误差增大。根据测试结果，选取k=1.025作为硫代硫酸钠溶液加入体积比例系数，即VN=1.025×T×VI。此条件下，测试方法的结果同电导率法测试结果对比，误差较小，为3.4%。

2.2比色法重复性和再现性

混合时间的变化是由于溶液体积测量的不准确、硫代硫酸钠溶液的添加时间计时不准确、是否肉眼观察判断、是否可见颜色条纹不准确以及重复使用过程中中性点调节不准确和不同人员的测试习惯所致。

2.3IVD实际生产应用

考虑到方法的准确性和商业风险，IVD实际生产中混合时间选取5min。对5min、15min、30min3组数据进行正态性检验，P＞0.05，符合正态分布；3组数据进行Bartlett等方差检验，P＞0.05，方差齐性；3组数据进行方差分析的单因子方差分析，P＞0.05，说明统计学上3组混合质量无显著差异。

对比原有参数，比色法获取的混合时间从15~30min缩短至5min，混合质量无显著差异。可以缩短生产混合时间，给予工业规模生产混合工艺的优化指导。典型的免疫产品约需要10步左右的均质化，包含加入盐类、防腐剂、表面活性剂、抗原/抗体，pH调节以及子溶液混合等均质化步骤，如单个均质化步骤能从15min缩短到5min，单个溶液配制可以节约近2h，原需要超过1个工作日完成的溶液配制工作有望在1个工作日内完成。相应的溶液配制人员和设备都可以解放出来进行下一批次的生产，提高生产效率，增加产能。

3结论

该比色法以经典颜色变化反应（碘量）作为基础，对不同规模的混合设备的混合时间进行了试验测试，建立了最大到3000L的工业规模混合设备的混合时间测定方法。该法适用于一定密度和粘度范围内的液体混合时间测定，测量结果相对准确。该法可以对现有的混合容器进行性能测试，用测得的混合时间指导和改进混合工艺，缩短混合时间，达到提高生产效率的目的。

参考文献

[1]曹春哲.比色法测定液相混合时间及其在体外诊断试剂生产中的应用[J].生物化工,2020,6(06):85-88.

[2]杨壮.无挡板搅拌槽内液相混合特性的数值模拟[D].北京化工大学,2020.

[3]张梦菲,刘凡,张阳,陈杰,王耐艳.液相混合辅助低温制备Ca_2Si_5N_8:Eu~(2+)荧光粉[J].浙江理工大学学报(自然科学版),2016,35(04):554-558.

[4]马立波,薛叙明,王思群,张洋.液相混合法制备纳米纤维素晶须/ABS复合材料[J].林业工程学报,2016,1(04):91-95.