棉签擦拭进行表面微生物取样-中国期刊网

棉签擦拭进行表面微生物取样

方法研究

1 秦阳阳 2 戴士筠

1天津金耀药业有限公司天津市 300457
2天津金耀药业有限公司天津市 300457

摘要：对于无菌制剂生产车间微生物控制具有至关重要的作用，目前表面微生物取样方法主要为接触碟法，而对于生产设备、部分拐角等采样点具有不规则性，无法使用接触碟法进行采样，因此使用棉签擦拭法进行表面微生物取样。为确认在不同材质上用棉签进行微生物擦拭取样方法的有效性及表面擦拭法回收率试验符合要求，故进行棉签擦拭法进行表面微生物取样方法研究。根据GMP及《中国药典》2020年版要求，棉签擦拭所获得的微生物菌落回收率应在50%～200%之间。

关键词：表面微生物棉签擦拭法回收率

1仪器和材料

1.1验证用具

1.1.1验证选用材质：经过对车间材质的评估，选用不锈钢、有机玻璃、硅胶、PVC地板四种材质作为代表进行验证。

1.1.2验证选用棉签：使用前需经121℃灭菌30分钟

表1：验证用棉签

材料名称	医用棉签
厂家	河南新飘安高科股份有限公司
生产许可证编号	豫食药监械生产许20150066号
产品注册证编号	鲁械注准20182640175号
规格	10cm
生产批号	016190101
失效年月	2021年7月

1.2验证用设备

验证中用到的设备均已完成设备验证且在验证有效期内。所用设备如表2所示。

表2：验证用设备

名称	设备型号	设备编号
脉动真空灭菌柜	SGLASE-RE1S	0230303119
普通卧式蒸汽灭菌器	XG1.C型	0230303117
生化培养箱	LRH-250A	023030318
生化培养箱	LRH-250A	0230303141
生物安全柜（SW02）	海尔	023030350
生物安全柜（SW03）	BSC-1100 II A2-X	023030349
冰箱	BCD-241TMCN	022030540
薄膜过滤器	三联不锈钢	64040011

1.3验证用培养基、试液

验证用培养基及试剂：验证中所使用的培养基均为干粉培养基进行配制，于121℃灭菌30min。各培养基适用性检查均符合规定且在有效期内。

表3 验证用培养基、缓冲液

名称	干粉培养基批号	厂家
胰蛋白大豆琼脂培养基（TSA）	4204530	BD
沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）	4139776	BD
胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）	4042276	BD
沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）	7053897	BD
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（SCB）	1805172	北京三药科技有限公司

1.4验证用试剂试药

表4 验证用试剂试药

名称	生产厂家	批号
聚山梨酯80	天津市科密欧化学试剂有限公司	20170110

1.5验证用菌种

菌种及其菌液制备：验证所使用的菌株为从CMCC标准菌株传代制备的工作菌株和从环境中分离出来的环境菌。菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

表5 验证用菌种

范围	菌种名称	菌种编号	代次
细菌	金黄色葡萄球菌	ATCC6538	3
	铜绿假单胞菌	ATCC9027	3
	大肠埃希菌	ATCC8739	3
产芽孢杆菌	枯草芽孢杆菌	ATCC6633	3
真菌	白色念珠菌	ATCC10231	3
真菌	黑曲霉	ATCC16404	3

2可接受的标准和限度

可接受的标准和限度如表6所示：

表6 可接受的标准和限度

验证材质	可接受标准
不锈钢	每一株菌株的回收率均在50%～200%。
有机玻璃	每一株菌株的回收率均在50%～200%。
硅胶	每一株菌株的回收率均在50%～200%。
PVC地板	每一株菌株的回收率均在50%～200%。

3方法

3.1菌液制备：

3.1.1接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至TSB中，30～35℃培养18～24小时，然后取上述培养好的菌悬液（浓菌液）1ml，加到9ml SCB混匀，为10^-¹，再取另一只刻度吸管吸取10^-¹菌液1ml加到9ml SCB混匀，为10^-² ……以此类推进行稀释，使成0.lml中含不大于100cfu的菌悬液。

3.1.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至SDB中，20～25℃培养24～48小时，取上述培养好的菌悬液（浓菌液）1ml，加到9ml SCB混匀，为10^-¹，再取另一只刻度吸管吸取10^-¹菌液1ml加到9ml SCB混匀，为10^-² ……以此类推进行稀释，使成0.lml中含不大于100cfu的菌悬液。

3.1.3接种黑曲霉的新鲜培养物至SDA斜面培养基上， 20～25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）无菌聚山梨酯80的SCB，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）无菌聚山梨酯80的SCB制成0.lml中含不大于100cfu的孢子悬液。

3.2验证方法：

3.2.1将各个材质切割成5cm×5cm测试载片，用洁洁灵及纯化水进行冲洗清洁。注意载片要用镊子夹持。对于洗净的有机玻璃、硅胶载片需放到70%异丙醇溶液中浸泡30分钟并在生物安全柜中充分晾干。对于洗净的不锈钢、PVC地板载片经蒸汽灭菌121℃30分钟后，在生物安全柜中充分晾干，备用。

3.2.2菌悬液接种量浓度应为不大于100cfu。将载片平铺于无菌平皿内，用移液器吸取0.1ml的待测菌悬液逐片滴加，并用接种环使菌液在表面充分铺展开来，干燥，备用。阴性对照组用载片应将载片平铺于无菌平皿内，用移液器吸取0.1ml的稀释剂逐片滴加，并用接种环使菌液在表面充分铺展开来，干燥，备用。

3.2.3表面擦拭操作方法：打开灭菌后棉签包装袋，取出棉签沾取灭菌水，将棉签按在材质表面上，用力使其弯曲，平稳而缓慢的擦拭材质表面。在向前移动的同时将其从一边移到另一边。擦拭过程应覆盖整个表面。翻转棉签，让棉签的另一面也进行擦拭。擦拭方向与前次移动方向垂直（擦拭方法如下图，擦拭面积25cm²）。擦拭完成后，将棉签头部用力在做好标识的西林瓶口折断，并盖紧胶塞密封。具体擦拭方法见图1。

图1擦拭方法图示

3.2.4表面菌检测：

3.2.4.1将擦拭棉签头放入装有100mlSCB的洁净瓶中充分振荡洗脱1分钟，移取少量缓冲液对小管进行冲洗，将洗脱液和冲洗液采用薄膜过滤法过滤，过滤完毕后，取100mlSCB冲洗过滤，过滤细菌、芽孢洗脱液的滤膜正面朝上放于TSA上，过滤真菌洗脱液的滤膜正面朝上放于SDA上，TSA于30～35℃培养3天，SDA于20～25℃培养5天，逐日观察。

3.2.4.2分别取100ml SCB采用薄膜过滤法过滤，分别在TSA、SDA上培养，作为阴性对照。

3.2.4.3将细菌、真菌、枯草芽孢杆菌制备成含菌量不大于100cfu的工作菌液（为了提高实验准确度），以便于表面擦拭菌落回收率计算。将以上制备好的菌液取不大于100cfu分别接种于滤膜上，用100ml冲洗液冲洗，采用薄膜过滤法过滤，分别在TSA、SDA上培养，作为阳性对照。

3.2.4.4将接种细菌、枯草芽孢杆菌的平皿放于30℃～35℃培养箱倒置培养3天，接种真菌的平皿放于20～25℃霉菌培养箱倒置培养5天。

3.2.4.5试验进行3次独立的平行试验，并分别计数每次试验菌的菌落回收率。

3.3结果计算

3.3.1表面菌擦拭菌落回收率计算公式：

菌落回收率=（擦拭25cm²表面生长的菌落数）÷工作菌液确认平皿的平均菌落数，式中：擦拭25cm²表面生长的菌落数：即接种含菌量不大于100cfu的菌液至25cm²方框中，经擦拭后两个平行检测平皿中生长的菌落数的算术平均值。

工作菌液确认平皿的平均菌落数：含菌量不大于100cfu 的工作菌液的两个确认平皿中生长的菌落数的算术平均值。

3.3.2验证结果统计

3.3.2.1金黄色葡萄球菌

菌液名称及批号	擦拭对象	试验号	试验组（cfu）	阳性对照组（cfu）	菌回收率（%）	结论
金黄色葡萄球菌 J20200510	不锈钢	1	73	89	82	√
		2	75	92	81	√
		3	76	91	83	√
	有机玻璃	1	74	88	84	√
		2	75	90	83	√
		3	77	91	85	√
	PVC地板	1	70	90	78	√
		2	71	94	76	√
		3	72	92	78	√
	硅胶	1	68	91	75	√
		2	64	89	72	√
		3	69	89	78	√
阴性对照			0			√

3.3.2.2铜绿假单胞菌

菌液名称及批号	擦拭对象	试验号	试验组（cfu）	阳性对照组（cfu）	菌回收率（%）	结论
铜绿假单胞菌 T20200510	不锈钢	1	74	91	81	√
		2	73	91	80	√
		3	74	90	82	√
	有机玻璃	1	78	91	86	√
		2	73	93	78	√
		3	72	93	77	√
	PVC地板	1	70	92	76	√
		2	67	90	74	√
		3	71	91	78	√
	硅胶	1	68	92	74	√
		2	68	92	74	√
		3	71	91	78	√
阴性对照			0			√

3.3.2.3大肠埃希菌

菌液名称及批号	擦拭对象	试验号	试验组（cfu）	阳性对照组（cfu）	菌回收率（%）	结论
大肠埃希菌 D20200510	不锈钢	1	76	90	84	√
		2	78	91	86	√
		3	75	94	80	√
	有机玻璃	1	74	91	81	√
		2	74	91	81	√
		3	72	91	79	√
	PVC地板	1	70	92	76	√
		2	71	92	77	√
		3	71	91	78	√
	硅胶	1	68	90	75	√
		2	68	90	75	√
		3	68	91	75	√
阴性对照			0			√

3.3.2.4白色念珠菌

菌液名称及批号	擦拭对象	试验号	试验组（cfu）	阳性对照组（cfu）	菌回收率（%）	结论
白色念珠菌 B20200509	不锈钢	1	77	92	84	√
		2	77	92	84	√
		3	74	93	80	√
	有机玻璃	1	74	92	80	√
		2	73	91	80	√
		3	75	94	80	√
	PVC地板	1	68	91	75	√
		2	69	91	76	√
		3	71	93	76	√
	硅胶	1	66	92	72	√
		2	67	90	74	√
		3	70	90	78	√
阴性对照			0			√

菌液名称及批号	擦拭对象	试验号	试验组（cfu）	阳性对照组（cfu）	菌回收率（%）	结论
枯草芽孢杆菌 K20200510	不锈钢	1	62	70	88	√
		2	60	73	82	√
		3	60	73	82	√
	有机玻璃	1	61	72	85	√
		2	60	72	83	√
		3	56	70	80	√
	PVC地板	1	54	72	75	√
		2	52	71	73	√
		3	53	71	75	√
	硅胶	1	52	70	74	√
		2	52	71	73	√
		3	51	71	71	√
阴性对照			0			√

3.3.2.5枯草芽孢杆菌

3.3.2.6黑曲霉

菌液名称及批号	擦拭对象	试验号	试验组（cfu）	阳性对照组（cfu）	菌回收率（%）	结论
黑曲霉 H20200511	不锈钢	1	45	53	85	√
		2	44	53	83	√
		3	45	52	87	√
	有机玻璃	1	43	54	80	√
		2	42	53	80	√
		3	45	56	80	√
	PVC地板	1	40	52	77	√
		2	38	53	72	√
		3	42	52	81	√
	硅胶	1	38	53	72	√
		2	41	54	76	√
		3	42	54	78	√
阴性对照			0			√

4结论

以上三批检验结果显示，各个菌种在不同材质上进行棉签擦拭所获得的微生物菌落回收率均在50%～200%之间，结果符合规定，棉签擦拭方法可行。

参考文献

[1]国家药典委员会编。中华人民共和国药典[S]。2020年版，中国医药科技出版社，2020.5。

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棉签擦拭进行表面微生物取样