IL-28B单核苷酸多态性在不同基因型慢性丙型肝炎患者中的分布

IL-28B单核苷酸多态性在不同基因型慢性丙型肝炎患者中的分布

罗旗 蒲光林 周金龙 唐旋 吴丽娟

安岳县人民医院 四川 资阳 642350

【摘要】目的 了解IL-28B基因多态性在不同丙肝病毒基因型的慢性患者中的分布情况。方法 收集到60例慢性丙肝（chronic hepatitis C, CHC）患者的抗凝全血，采用多重高温连接酶检测反应检测IL-28B 单核甘酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPS）位点rs8099917, rs12980275, rs12979860。结果 ①60例CHC患者中非1b型占71.7%（43/60）, 1b型占28.3%（17/60）, IL-28BSNPS位点rs8099917TT,rs12980275AA,rs12979860CC基因型占80%（48/60），在HCV基因1b型组中rs8099917GT,rs12980275GA, rs12979860CT基因型占58.8%（10/17）。IL-28BSNPS在1b型与非1b型分布存在差异，差异有统计学意义。（P=0.00<0.05）。②ALT，AST，GGT及病毒载量在TT/AA/CC基因型组与GT/GA/CT基因型组间，无显著性差异。结论 HCV基因非1b型的CHC患者大部分为rs8099917TT，rs12980275AA，rs12979860CC基因型。IL-28BSNPSrs8099917,rs12980275,rs12979860三个位点间有很强的连锁不平衡。

【关键词】IL-28B单核苷酸多态性；连锁不平衡；丙肝病毒基因型；慢性丙型肝炎患者

Distribution of IL-28B single nucleotide polymorphism to patients with chronic hepatitis C in different genotype LUO Qi,LIU Fei-fei,YUAN Qin et al. The First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Key Laboratory of Infectious and Parasitic Diseases in Chongqing，Department of Infections Disease，Chongqing 400016，China

【Abstract】objective To investigate the distribution of IL-28B gene polymorphism in chronic patients with different genotype of hepatitis C virus。Methods 60 cases of chronic hepatitis C (chronic hepatitis C, CHC) in patients with anticoagulant whole blood were collected. IL-28B single nucleotide polymorphisms of (single nucleotide polymorphisms, SNPS)rs8099917,rs12980275and rs12979860 was tested by multiple high temperature ligase detection。Results ①The percentage of patients in non-genotype 1b was 71.7%(43/60),genotype 1b accounted for 28.3%(17/60)。IL-28B SNPS of rs8099917TT,rs12980275AA,rs12979860CC was 80%(48/60) in patient with chronic hepatitis C。the IL-28B SNPS of rs8099917GT,rs12980275GA, rs12979860CT was 58.8%(10/17) in patients with genotype 1b。There was different on the distribution of IL-28B SNPS between genotype 1b and non-genotype 1b(P=0.00<0.05），this difference was statistically significant 。②There were no significant difference with ALT, AST, GGT and viral load in the TT/AA/CC and GT/GA/CT genotype group。

Conclusion HCV genotype non-1b of CHC patients mostly carried rs8099917TT, rs12980275AA, rs12979860CCgenotype。The IL-28 B SNPS of rs8099917， rs12980275, rs12979860 was strong linkage disequilibrium。

【Key words】 IL - 28B single nucleotide polymorphism；linkage disequilibrium ；hepatitis C virus (HCV) genotype；patients with chronic hepatitis C

作者介绍：罗旗 ，女，硕士

E-mail:luoqichongqing@sina.com

慢性丙型肝炎（CHC）的标准治疗是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林，其个体化治疗策略主要根据病毒基因型和治疗过程中的病毒学应答^【1】。根据这些治疗方案，1型HCV （hepatitis C virus ，丙肝病毒）患者的SVR率（sustained virological response ,持续病毒学应答）约为42~79%，2和3型HCV患者的SVR率为76~95%^【2】。值得我们关注的是，在亚洲人群中，1型HCV患者的SVR率高达61%~79%^【3,4】，2和3型HCV患者SVR率达80%~95%^【5,6】。长期以来，我们将这种治疗效果的差异归因于不同种族的遗传背景。最近通过全基因组研究发现IL-28BSNPS（single nucleotide polymorphisms of Interluekin-28B，白介素-28B单核核苷酸多态性）与患者达到SVR紧密相关，而且发现IL-28BSNP位点rs12979860优势C等位基因在亚洲人中更高，在非裔美国人中较低。另外，rs12979860CC等位基因频率与不同人群达到SVR的频率相一致^【7,8】。进一步发现rs12979860基因型和丙肝病毒自发清除，及治疗过程中的病毒学应答相关^【9】,可作为抗病毒治疗策略的重要参考因素。大量研究表明IL-28BSNPS的rs12980275,rs8099917位点与SVR也高度相关^【10】。但IL-28BSNPS间是否相互影响，在我国CHC患者中具体分布情况仍不清楚。本文就IL-28B基因多态性位点相互间的关系及在慢性丙肝患者不同病毒基因型中的分布情况做进一步研究。

1.对象及方法

1.1 研究对象 前瞻性纳入2017年9月至2019年2月在安岳县人民医院诊就诊的CHC患者，诊断符合2004年中华医学会丙型肝炎防治指南^【11】，血清抗-HCV和HCV-RNA皆阳性。排除标准：合并其他肝炎病毒感染，失代偿期肝硬化者，妊娠期和哺乳期妇女，人类免疫缺陷病毒（HIV）感染，未控制的自身免疫性疾病患者等。签署知情同意书。共纳入符合标准的CHC患者60例。（见表1）

1.2 观察指标 分别采用荧光定量PCR检测HCV-RNA载量，生化仪检测肝功能，以上检测均由成都高新达安医学检验科测定。低病毒载量定义为：HCV-RNA<10^6 copies／ml，高病毒载量定义为：HCV-RNA≥10^6 copies／ml。

1.3 提取基因组DNA 用EDTA抗凝管抽取患者晨空腹血3ml,按照TaKaRa基因组试剂盒说明书提取DNA，配制1%琼脂糖凝胶，3ulDNA样本混合1ul loading buffer点样，120V电泳30~40min,进行质量检测及浓度估计。

1.4 IL-28B基因型检测 PCR引物参照PubMed基因库中rs8099917,rs12980275,rs12979860核心序列，根据相关的引物设计软件构建，并由上海生工合成。多重PCR扩增引物如表2所示，反应体系为1x GC-I buffer(Takara), 3.0 mM Mg2+, 0.3 mM dNTP, 1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc) ，1 µl 样本DNA和引物各1ul，扩增体系10ul,PCR条件首先95ºC 2min，94℃ 20s,65ºC 40s ,72ºC 1.5min，11个循环，每个循环递减0.5ºC。其次 94ºC 20s，59ºC 30s， 72ºC 1.5min，24个循环。最后72℃ 2min，4℃维持。将5U SAP酶和2U Exonuclease I酶加入PCR产物中进行纯化。设计连接引物见表2, 连接反应体系为10x 、连接缓冲液 1ul、高温连接酶 0.25ul、5’连接引物混合液（1µM）0.4ul，3’连接引物混合液（2µM）0.4ul、纯化后多重PCR产物 2ul、ddH

₂O 6ul 混匀。94℃ 1min,56℃ 4min,循环38次，4℃维持。取0.5μl 稀释后的连接产物，与0.5μl Liz500 SIZE STANDARD， 9μl Hi-Di 混匀， 95 ºC变性5分钟后上ABI3730XL测序仪。GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems, USA) 分析数据。

1.5统计学处理 采用 SPSS17.0软件对数据进行统计学分析,计量资料数据以±s表示。两样本均数比较，符合正太分布采用两独立样本均数的t检验,非正太分布采用秩和检验。率的比较采用2或者Fisher确切概率法进行检验。p<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1绘制rs8099917,rs12980275,rs12979860间的LD图 利用Hardy-Weinberg平衡检验方法，对本组CHC患者进行分析，根据观察数与计算的基因型期望数比较，差异无统计学意义(P>0．05)，符合Hardy—Weinberg平衡。提示样本基因型分布是均匀的，具有群体代表性。通过LDMP软件（http://cedar.genetics.soton.acuk/public-html）绘制LD图，发现rs8099917,rs12980275,rs12979860有很强的连锁不平衡，rs12979860作为这一单倍型的代表。（见图1）

图1:rs8099917,rs12979860,rs12980275相互间的连锁不平衡在IL28B基因区域的LD图。（19号染色体，核苷酸位39731783-39743165）

2.2IL-28BSNPS分布 60例CHC患者，HCV基因1b型（17例，28.3%），2型（1例，1.7%），2a型（2例，3.3%），3b型（20例，33.3%），3a或3k(10例，16.7%),5a型（2例，3.3%），6a型（8例，13.4%）。1b型占28.3%(17/60)，非1b型占71.7%(43/60)。rs8099917TT基因型、rs12980275AA基因型、rs12979860CC基因型占80%(48/60),rs8099917GT基因型、rs12980275GA基因型、rs12979860CT基因型占16.7%（10/60)。见表3

2.3 不同HCV基因型中IL-28BSNPS分布差异 在HCV基因1b型中rs8099917TT基因型,rs12980275AA基因型,rs12979860CC基因型占41.2%(7/17),rs8099917GT基因型,rs12980275GA基因型,rs12979860CT基因型占58.8%（10/17）。其中1例3b型为rs8099917GT基因型,rs12980275GG基因型,rs12979860TT基因型。1例3b为rs8099917TT基因型,rs12980275GA基因型,rs12979860CT基因型。41例非1b型均为rs8099917TT基因型，rs12980275GG基因型，rs12979860CC基因型。通过连续性校正公式计算^２ 值，P=0.00<0.05,说明IL-28BSNPS在1b型与非1b型CHC患者中分布存在差异，差异有统计学意义。

2.4 IL-28BSNPS与病毒载量及肝功能关系 48例rs8099917TT基因型，rs12980275GG基因型，rs12979860CC基因型病毒载量为(5.5±1.2)log10IU/ml,10例rs8099917GT基因型，rs12980275GA基因型，rs12979860CT基因型病毒载量为(5.6±1.5)log10IU/ml,两组间病毒载量无明显差异（P>0.05）。48例rs8099917TT基因型，rs12980275GG基因型，rs12979860CC基因型ALT为(71.2±73.2)U/L,AST为( 57.4±38.6)U/L,GGT为(42.4±42.4)U/L依次与10例rs8099917GT基因型，rs12980275GA基因型，rs12979860CT基因型ALT为(55.3±38.6)U/L,AST为(60.2±44.3)U/L,GGT为(28.7±16.4)U/L相比,两组间ALT，AST，GGT均无显著差异（P>0.05）。（见图2A，B）

A B

图2：HCV病毒载量及ALT在IL-28BSNPs中的分布情况。（A）HCV病毒载量均值在IL-28BSNPS rs8099917TT基因型,rs12980275AA基因型,rs12979860CC基因型组较rs8099917GT基因型,rs12980275GA基因型,rs12979860CT基因型组低。（B）ALT均值在IL-28BSNPS rs8099917TT基因型，rs12980275AA基因型，rs12979860CC基因型组较rs8099917GT基因型，rs12980275GA基因型，rs12979860CT基因型组高。

3.讨论

本研究以IL-28B附近的三个SNPS位点为研究点，发现rs8099917TT基因型，rs12980275AA基因型，rs12979860CC基因型同时出现在约80%（48/60）CHC患者中。而rs8099917GT基因型，rs12980275GA基因型，rs12979860CT基因型主要分布在1b型CHC患者中，约占58.8%（10/17）。在非1b型中，我们发现1例rs8099917TT基因型，rs12980275GA基因型，rs12979860CT基因型和1例rs8099917GT基因型，rs12980275GG基因型，rs12979860TT基因型。大量研究表明rs8099917TT基因型,rs12980275AA基因型，rs12979860CC基因型均为优势基因型，rs8099917GT/GG基因型，rs12980275GA/GG基因型，rs12979860CT/TT基因型均为劣势基因型^【12,13】。说明中国CHC患者中IL-28BSNPS基因型主要以优势基因为主，对长效干扰素联合利巴韦林治疗丙型肝炎的病毒应答率较高。另外，IL-28BSNPS在HCV基因1b型与非1b型的分布有存在差异，不同基因型的丙肝病毒清除与IL-28BSNPS有密切关系，具体机制有待进一步研究。Ge 等^【10】发现rs12979860CC基因型有更高的SVR。McCarthy等^【14】研究发现， rs12979860CC基因型的CHC患者比rs12979860CT/TT基因型患者的SVR率高6倍。在CHC患者治疗前，接受IL-28BSNPS的检测，有助于个体化治疗方案的制定。

rs8099917,rs12980275,rs12979860分别位于IL-28B基因上，编码IFN-λ，与IIFN作用相似，通过JAK-STAT途径，刺激ISGS(IFN-stimulated genes)表达,介导抗病毒应答^【15】。大量研究发现^【16】，rs12979860CC基因型患者的转氨酶水平比rs12979860CT/TT基因型患者高，并且rs12979860CC型患者大部分为有症状者。rs12979860CC基因型患者的HCV病毒载量也更高^【14】。我们研究发现在rs8099917TT基因型，rs12980275AA基因型，rs12979860CC基因型组的HCV病毒载量与rs8099917GT基因型，rs12980275GA基因型，rs12979860CT基因型组无明显差异，rs8099917TT基因型，rs12980275AA基因型，rs12979860CC基因型组ALT较rs8099917GT基因型，rs12980275GA基因型，rs12979860CT基因型组高，但两组差异无统计学意义。说明不能根据病毒载量高低、肝功能损伤程度推断IL-28BSNPS基因型。研究结果不同，可能与研究的人群不同相关。

总之，HCV基因非1b型CHC患者主要以IL-28BSNPSrs8099917TT基因型，rs12980275AA基因型，rs12979860CC基因型为主，这三个SNPS间存在很强的连锁不平衡。检测IL-28BSNPS其中一个位点，基本能够推断出另两个位点，有助于CHC患者的个体化治疗方案制定，减轻患者经济负担。

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