微生物检验技术基础

微生物 检验技术基础

王豫川

绵阳市人民医院 四川绵阳 621000

随着由微生物带来的健康问题的不断增加，微生物检测逐渐在临床上得到了广泛的应用，下面我们就对微生物检验技术的一些基础知识和问题进行介绍。

1、沙门氏菌检验中血清学试验常见问题
血清学鉴定是沙门氏菌检验中的重要鉴定方法，包括菌体抗原（0）鉴定、鞭毛抗原（H）鉴定和Vi抗原鉴定。由于血清学试验涉及的内容很多，所以我们在此给大家列出几个常见问题，以供大家在日常工作中参考。
（1）沙门氏菌判定时以生化试验结果为主还是血清学试验结果为主？
我们在判定时应该以生化试验结果为主，在生化试验的基础上进行血清学判定。有的试验人员会直接用多价血清进行试验，不进行生化试验，这是绝对不可取的。因为血清学的原理是抗原抗体结合，非沙门氏菌的微生物也有可能带有沙门的类似抗原的。所以我们做鉴定的时候，必须先进行生化试验，在生化试验的基础上进行血清学鉴定。
（2）血清学试验要做到什么程度？
如果我们只需要鉴定某个菌株是否属于沙门氏菌，那只需要做0多价和H多价血清就可以了。如果需要鉴定某个菌株具体是什么沙门氏菌，比如是否为鼠伤寒沙门氏菌或是否为肠炎沙门氏菌，那就需要进行血清学分型试验，从多价血清一直做到0抗原和H抗原的单因子，然后参照GB4789.4-2016沙门氏菌检验标准中附录B的表格查找对应的沙门菌名。

2、大肠菌群MPN法
（1）试验所依据的标准
首先，查看要求MPN值的单位，是MPN／g还是MPN／100g。如果是MPN／g，按照GB4789.3-2010进行试验；如果是MPN／100g，依据卫生部颁布的通知要求，可以按照GB4789.3―2003进行试验。
（2）双料的接种和MPN表的检索方法
如果制备的稀释度为10-1、10-2、10-3。其中，10-1取10mL接种于3管双料初发酵培养基中，另取10-11mL接种于3管单料初发酵培养基中，10-2取1 mL接种于3管单料初发酵培养基中。完成MPN法的初发酵接种。
最后判定结果时，要依据复发酵的结果来推出初发酵为阳性的管数，再结合初发酵接种的稀释度为1，0.1，0.01。检索MPN表进行判定，注意表内MPN值随稀释度的变化有相应的变化。
（3)如何判定产气
在MPN法中，初发酵和复发酵阳性管的主要判定依据是产气，但做样品检测时，很多时候大肠菌群的产气量不多，在小导管中很难看到，这时不能直接判定为阴性。轻轻晃动试管，然后将试管倾斜一定角度，如果有大量小气泡从底部升上来，并有逐渐增多的趋势，可判定为阳性。
3、生化试验可疑菌纯化的目的
致病菌检测过程中，生化试验或者初步筛选以后确证性试验以前，一般要求将可疑菌菌落纯化于特定营养型平板上，比如单增李斯特检验使用TSA-YE进行可疑菌纯化，沙门氏菌和志贺氏菌检测使用营养琼脂进行纯化。可疑菌纯化的目的有如下几点：
（1）根据纯化以后的平板上生长的菌落大小及形态，可以判断挑取的可疑菌是不是单独的纯菌落，有没有发生菌落叠加现象。
（2）生化试验一般项目较多，选择性分离平板上的可疑菌一般都带有颜色，无法制作菌悬液。生长较小的可疑单菌落无法满足接菌量要求，而且不能保证每个项目接菌量相同。实验结果会有差异。而纯化以后的平板上的所有菌落均来源于同一个单菌落，有大量的菌供生化试验使用。
（3）选择性分离平板一般都成分复杂，并且有一定抑制性，其中可能含有某些对个别生化产生影响的物质。而用于纯化的平板都是营养型的，不会对生化项目造成影响。
4、0多价血清不凝集，就一定是0抗原阴性么？
我们在做0多价血清时，如果没有凝集并不能直接判定为阴性，因为我们还要考虑Vi抗原的影响。Vi抗原属于K抗原群，是会阻隔0抗原和相应抗体的结合，所以有Vi抗原存在时，0多价血清是不会凝集的。GB4789.4-2016沙门氏菌检验标准中提到已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌和都柏林沙门氏菌。因此，我们必须去除Vi抗原的影响。具体方法是将待检菌做成浓菌液，放入100℃沸水中煮沸15-60分钟，目的是破坏Vi抗原，然后再挑取菌液做0多价血清。如果还是不凝集，才能判定为阴性。
5、荧光实验结果观察
日常试验中，经常会遇到大肠杆菌需要观察荧光是情况。国标GB 4789.38-2012大肠埃希氏菌计数中第二法（VRBA-MUG计数），GB/T 5750.12-2006 水及水源水中的大肠埃希氏检验，都需要观察荧光，可见荧光结果观察的重要性。
MUG是4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷的缩写，该物质为β-半乳糖苷酶作用的底物，β-半乳糖苷酶与MUG结合并剪切β-半乳糖苷键，释放荧光显色基团4-甲基伞形酮，在紫外光（入＝366nm）下观察，培养物发出蓝色荧光。
（1）观察荧光的条件：
1）紫外光为366nm波长；

2）在黑暗的环境下观察，有助于更好的观察荧光；
3）紫外灯灯管最好直接照射在待测平板或试管上，无玻璃等物品吸收紫外光。
4）使用空白管、阳性菌、阴性菌做对照。
推荐使用“简易便携式荧光检测灯”，不但具备以上三个要求，而且避免了紫外灯直接照射人的情况，对实验人员有所保护。
（2）空白产荧光原因分析：
1）试管或平血洗涮不干净所致。试管或平血中残留4-甲基伞形酮，会导致空白有荧光。
2）观察荧光的紫外灯不合适。紫外灯波长虽为366nm，但外侧有玻璃灯罩、或者功率太大（瓦数太高、灯过亮）均会影响荧光效果。
3）试管或平血本身原因。有些试管或平血，本身由于质量原因，在紫外灯下自身就带有光亮。使用前，可以先拿几种试管或平血装入蒸馏水，先在紫外灯下观察一下，然后挑取亮度比较暗的容器使用。