­­辣椒中硫氧还蛋白基因Trh9的克隆及功能分析

­辣椒中硫氧还蛋白基因Trh9的克隆及功能分析

李再超

武昌首义学院 湖北 武汉 430064

摘要：硫氧还蛋白( Thioredoxin，Trx)是重要的酶活力调节蛋白，在植物、动物、细菌中均有发现，它是仅有12kd的一类酸性蛋白，在多种反应中起到重要作用，如氧化还原载体的功能。本研究克隆了硫氧还蛋白基因Trh9，用Gateway技术构建Trh9基因及其过表达载体35S: Cath9，农杆菌转化之后进行注射，使用科学测试方式查看测其死亡状况，最终可知 Trh9在辣椒叶片的过表达可以造成细胞死亡，表示此基因也许和其抗病属性相关。

关键词： 硫氧还蛋白 辣椒 Gateway技术 Trh9基因

辣椒( Capsicum frutescens L．)为茄科植物，不仅是重要的蔬菜和调味品，具有极高的营养价值，补充人体需要的碳水化合物，维生素及钙、磷、铁矿物质等，同时还可入药，具有很好的保健功效，如驱寒止痛等功效。大面积种植辣椒也遇到众多病虫害和疫病问题，导致减产乃至绝收。使用化学药剂不能完全解决问题，反而会给环境和人类健康带来危害。因此，防治辣椒疫病以及病虫害的关键是改良筛选抗病品种，提高辣椒的抗病性。

1试验方法与步骤

1.1利用gateway技术构建Trh9基因及瞬间表达载体

首先以辣椒cDNA为模板，通过PCR技术分离并克隆Trh9基因，并进行测序。然后用Gateway中的BP反应方法，将全长的Trh9 cDNA构建到入门载体PDONR207上，提取Trh9-PDONR207的质粒，再用Gateway中LR反应的方法将Trh9-PDONR207构建到目的载体3687的植物表达载体中，即获得过表达载体35S:Cath9，然后用获得的过表达载体35S:Cath9转化农杆菌进行下一步实验。

1.2农杆菌转化及PCR鉴定

（1）在具有100μL农杆菌感受态细胞内增加质粒混合液（未含SRDX短肽）10μL。把具有混合液离心管放到液氮盒内进行操作，取出管，增加500-1000μL未包含抗生素的液体LB培养基放到28℃摇床。选取之前转化菌液，在含有卡那霉素与利福平的LB平板上涂布，放到28℃培养箱内。等到产生菌落，挑选未连接的菌落到上述LB培养基的离心管内。反复上述环节进行含SRDX短肽的质粒混合液的农杆菌转化。

（2）选择少数农杆菌菌液，在99℃温度下加热十五分钟，促使其细胞壁破裂。之后使用内侧特异性引物鉴定PCR。上述反应系统和程序和BP反应相同。结束之后将扩增产物在1%琼脂糖凝胶内电泳20min(120V)，进而使用工具查找最终产物，此外全部记录。依照结论选择阳性克隆，扩增繁殖且储存，使用到后续的测试中。

1.3辣椒苗的处理及叶片的瞬间表达分析

（1）辣椒苗的处理

将Trh9-3687转化的农杆菌当做实验组，Trh9与PK7空载体是对照组，把上述两组农杆菌放到培养基中一整天。在菌液吸光度是1.0时，把其放在8000 rpm的离心机中操作，舍弃上清，采用VIGS侵染液重悬沉淀，调整吸光度是0.8。之后使用重悬后的农杆菌液对生长大概4周的辣椒苗叶片实施喷施。继而放到房间内培养且查看表型变化，开展后续测试。

（2）组织化学染色

DAB染色（二氨基联苯胺法）：选取经过上述两组的辣椒叶片各10片，在清洁之后放到DAB染色液中处置八小时，使用95%乙醇溶液在沸水浴内洗脱二十分钟，在显微镜下查看叶片且全部记录。台盼蓝染色（Trypan blue）：剪取上述两组辣椒叶片各10片，清洗后放到台盼蓝染色液中，沸水煮五分钟。无光照八小时，之后使用1%水合氯醛进行脱色，选取叶片观察，拍摄记录。

2结果与分析

2.1Trh9基因分离克隆的结果分析

以辣椒的cDNA为模板，设计Trh9的特异扩增引物进行PCR扩增，得出长度大概是500bp的PCR扩增片段（图1），把最终产物以pDONR-207为载体转化大肠杆菌，选取质粒且开展测序。对最后结论开展序列比较，得知其和辣椒基因组数据库序列相同，得到我们需要的基因。

图1 Trh9基因PCR产物电泳图

把基因序列添加到NCBI网站开展BLAST测试，说明该基因是一个硫氧还蛋白，编码氨基酸152个。对Trh9编码氨基酸的同源蛋白进行比对分析，结果发现辣椒Trh9与烟草，番茄，牵牛花同源性比较高，而且发现其保守的活性位点（WCGPC），说明它是Trx h的一个成员。

2.2构建Trh9基因的过表达载体

图2辣椒Trh9蛋白的同源比对分析

使用gateway技术对Trh9基因创建瞬间表达载体，利用BP与LR反应，把Trh9基因片段关联到pk7载体。采用以上基因转化农杆菌，对转化产物实施PCR扩增，最后产物长约500 bp， 和Trh9基因长度符合，表示转化顺利。

2.3构建Trh9-3687的过表达载体

PCR扩增之后创建到3687载体内，转化结束之后，开展PCR验证，结论如图3，根据图可知最后产物符合预期，表示顺利得到

Trh9-3687的瞬间表达载体。

图3 农杆菌转化后的PCR产物电泳图

2.4辣椒叶片组织化学染色结果与分析

注射Trh9-3687的辣椒叶片被大范围被染成蓝色，但是注射3687（对照）辣椒叶片只是在注射点被染色。当植物遭受侵染之后，受侵染点四周组织或细胞会马上坏死，避免病原菌扩散到未被浸染部分。DAB染色时，过氧化物酶处于细胞内，可以释放过氧化氢内的氧，产生金黄色沉淀。

图4 台盼蓝染色的结果图

4讨论

4.1辣椒硫氧还蛋白的基因序列及功能保守性

用ExPasy网预测分析结果表明基因编码152个氨基酸。使用NCBI的保守功能区域研究程序来进行预估，结论指出该基因为I类Trx家族基因，此处编码蛋白具备硫氧还蛋白相对保守的活性中心序列胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-胱氨酸（CGPC）。在茄科植物以及非茄科植物的硫氧还蛋白基因Trh9基因序列的多重比较中，也发现其序列的保守性。硫氧还蛋白的作用贯穿植物生长过程始终，其中各个基因各司其职，基因之间的序列相似性很高，在不同生长发育阶段参与植物正常生理活动。

4.2 Trh9基因与辣椒的抗病反应相关

当前主要使用DAB与台盼蓝染色法对不同组别的辣椒叶片进行染色，依照最终结果可知，注射Trh9-3687的辣椒叶片经过染色后出现显著的过敏反应，染色突出，但是对照组染色效果不突出，表示Trh9基因表达遭受抑制会造成植物细胞程序性死亡，和其抗病性有相应的关系。

参考文献

[1]张庭跃,赵晨曦,陈思学,李洪丽.甜菜M14品系BvM14-Tpx基因克隆及原核表达体系下应答氧化胁迫功能的初步研究[J].中国农学通报,2020,36(32):30-38.

[2]范新悦. 禾谷镰刀菌硫氧还蛋白还原酶TRR基因功能研究[D].山东农业大学,2019.

[3]李云飞,桑娜,刘慧,于秀立,张亭亭,黄先忠.棉花硫氧还蛋白基因GhWCRKC2-5参与开花调控的功能研究[J].石河子大学学报(自然科学版),2018,36(06):774-782.

[4]谢婧. 豌豆根瘤菌硫氧还蛋白基因trxs的功能研究[D].中南民族大学,2019.