激光辅助孵化在透明带异常患者中的临床应用

激光辅助孵化在透明带异常患者中的临床应用

赵彩岩

沈阳九州家园医院（原单位沈阳204医院）110013

【摘要】目的：探讨激光辅助孵化（LAH）对透明带异常患者临床妊娠结局的影响。方法：随机选取2018年1月至2019年5月在我院生殖医学中心行辅助生殖治疗的透明带异常患者200例并平均分为两组，行激光辅助孵化（LAH）的组别称之为LAH组，并未行激光辅助孵化的组别称之为对照组。两组患者的内膜厚度、体重指数及年龄等比较差异无统计学意义（p＞0.05）。分析透明带异常患者的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率以及流产率、畸形率和多胎率等妊娠情况。结果：LAH组的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率均显著高于对照组（29.4%vs13.5%；58.9% vs37.6%；42.83%vs20.41%），差异有统计学意义（p＜0.05）。而LAH组和对照组间的流产率、畸形率和多胎率比较差异无统计学意义（p＞0.05）。结论：激光辅助孵化（LAH）可以提高透明带异常患者的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率，改善临床妊娠结局，没有增加流产率、畸形率和多胎率等不良结局的风险。

【关键词】激光辅助孵化；透明带异常；种植率；临床妊娠率；活产率

透明带是环绕在卵细胞外的一种非细胞结构，其主要组成为糖蛋白。透明带在卵子受精至胚胎早期发育这一复杂的过程中起着重要作用[1]。不仅有利于正常受精，还对早期胚胎起到保护作用，防止发生多精受精、胚胎被细菌和真菌污染及生理损伤，保持胚胎的完整性[2]。正常生理情况下，透明带在胚胎进行第一次或第二次有丝分裂时开始逐渐变薄，到晚期囊胚期，透明带已薄到极易被突破的程度。在多种物理的以及生化的因素作用下，晚期囊胚最终突破透明带，从中完全逸出(这一过程被称之为孵化)，准备植入子宫内。如果由于某种原因，胚胎不能完成孵化过程，则无法植入子宫内，导致妊娠失败。在体外受精的临床实践中，人们观察到：经过体外培养后的母体的卵子，在体外受精形成胚胎之后，弹性降低。同时来自于年龄较大的母体的卵子，在体外授精形成胚胎之后，其透明带硬度较高或厚度增加[3-6]。这种透明带硬度或者厚度改变的现象，可能是造成胚胎在转移回子宫后，不能成功地植入内膜，导致着床失败的原因之一。

激光辅助孵化（LAH）是对透明带进行削薄或打孔，帮助胚胎从透明带中顺利孵出，从而提高透明带异常患者的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率。激光辅助孵化技术使用非接触式红外激光器，通过显微镜传递方式作用于靶区而使透明带被快速和可控的显微切割，该技术是一种简便、快速、安全的方法，被广泛应用于临床中。本次研究将探讨激光辅助孵化（LAH）对透明带异常患者临床妊娠结局的影响。

1资料与方法

1.1一般资料

本次研究随机选取2018年1月至2019年5月在我院生殖医学中心行辅助生殖治疗的透明带异常患者200例并平均分为两组，行激光辅助孵化（LAH）的组别称之为LAH组，未行激光辅助孵化的组别称之为对照组。透明带异常诊断标准：①透明带外观在光学显微镜下表现为透亮且致密，透明带厚度大于15um；②形状不规则，边缘毛刺状；③卵周间隙表现为小或者未见卵周隙；④透明带内有碎片。纳入标准：①常规长方案促排卵。②年龄在38岁以内。③夫妻双方染色体核型分析正常。④排除合并子宫畸形或病变的患者，如子宫肌瘤、重度子宫内膜异位症、输卵管积水等症状等。

进入排除后实际进入LAH组和对照组的患者各为100例，所有行LAH治疗的患者夫妇均签署知情同意书。其中，LAH组中的年龄在26～38岁之间，平均年龄为（32±4.5）岁，体重指数为（21.93±2.84）kg/㎡，移植时子宫内膜厚度为（9.5±1.6）mm。对照组的年龄在25~38岁之间，平均年龄（31±4.8）岁，体重指数为（22.19±2.98）kg/㎡，移植时子宫内膜厚度为（9.7±1.7）mm。所有患者治疗期间依从性较好，无一例退出治疗。两组患者的内膜厚度、体重指数及年龄等比较差异无统计学意义（p＞0.05）。

1.2方法

（1）促排卵方案：进行常规的方案进行促排卵，在B超下行卵泡监测，待主导卵泡直径达到18～20毫米，当晚注射HCG，HCG注射36小时左右后取出卵。取卵后根据适应证和精液情况行IVF或ICSI。受精后第1～3天观察胚胎发育情况。

（2）胚胎玻璃化冷冻复苏：玻璃化冷冻试剂采用加藤(KITAZATO)公司的VT101。首先将胚胎移入1液中1min，然后转入2液3～5 min，最后转入3液中30s，迅速放入冷冻麦管投入液氮，操作均在室温下进行。玻璃化冷冻复苏均采用加藤(KITAZATO)公司的VT102。复苏时迅速将冷冻麦管胚胎端置于1液中1min(37℃)，依次移入2液、3液、4液中各3min(室温)，最后将胚胎移入G-2 培养液，放于37℃、体积分数6% CO2培养箱中。复苏后成活卵裂球数≥50%的胚胎为胚胎复苏存活。

（3）激光辅助孵化程序：采用1.48μm非接触式激光（Research Instruments Ltd生产的Saturn 5 Active型透明带红外激光光学系统，英国）对LAH组进行胚胎透明带薄化。将解冻胚胎置于40倍倒置显微镜（NIKON TI-U，日本）视野中央，调整调整镜头至激光位，取卵周间隙最大部位或碎片较集中区域进行LAH，孵化区域约为80μm（约相当于总透明带总1/4周长），深度为透明带总厚度的50%～80%，次日上午移植。

（4）临床妊娠判断：移植后14 d进行血或尿HCG或β-亚基-人线毛膜促性腺激素（β-Human Chorionic Gonadotropin，β-HCG）测定，如为阳性，移植后28～35d行超声检查示子宫腔内见妊娠囊及原始心管搏动即可确定为胚胎种植成功，即临床妊娠。

1.3评价标准

分析透明带异常患者的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率以及在流产率、畸形率和多胎率等不良结局的风险程度。

1.4统计学处理

本次研究采用spss22.0统计学软件对所有的数据进行分析，计量资料使用均数±标准差表示，所有数据均符合正态分布，用t实验进行组件比较技术资料用卡方检验进行分析，当p＜0.05时，观察组和对照组患者的数据差异有统计学意义。

2结果

2.1分析两组胚胎种植率、临床妊娠率和活产率情况

激光辅助孵化技术（LAH）可以提高透明带异常患者的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率，具体如表1所示：

表1 两组胚胎种植率、临床妊娠率和活产率情况表（n,(％)）

组别 例数 胚胎种植率 临床妊娠率 活产率

LAH组 100 29.4 58.9 42.83

对照组 100 13.5 37.6 20.41

²值 -- 10.96 7.83 12.73

P值 -- 0.021 0.001 0.003

根据表1可以得知，LAH组的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率会显著高于对照组，并且两组数据差异有统计学意义（p＜0.05），p值分别为0.021、0.001和0.003，均小于0.05。

2.2分析两组流产率、畸形率和多胎率情况

表2 两组流产率、畸形率和多胎率情况表（n,(％)）

组别 例数 流产率 畸形率 多胎率

LAH组 100 5.2 0 12.3

对照组 100 7.9 0 14.0

²值 -- 2.63 —— 4.82

P值 -- 0.051 —— 0.096

由表2可以得知，两组流产率、畸形率和多胎率情况的数据差异均无统计学意义（p＞0.05），流产率数据比较p值为0.051>0.05，多胎率数据比较p值为0.096>0.05。所以激光辅助孵化并没有增加流产率、畸形率和多胎率等不良结局的风险。

3讨论

透明带在受精和早期胚胎发育过程中起着重要作用。在胚胎发育过程中 , 透明带会逐渐变薄，使囊胚易于孵出。延长时间的卵子培养和胚胎培养会导致透明带硬化，女性年龄的增长会导致透明带厚度的增加，透明带失去弹性、增厚或变硬使胚胎不能从透明带中孵出是目前IVF-ET植入失败率较高的一个原因。在体外受精－胚胎移植技术中采用辅助孵化就是指在胚胎移植前，借助显微操作技术在透明带上形成一个开口或消减透明带厚度，促使胚胎从透明带中孵出[7]。

辅助孵化最早在1990年被Cohen提出，随着该技术的不断进步和发展，AH经过了机械切割、化学、蛋白酶、Piezo显微操作和激光等几种方法。据其他学者的研究分析，对于辅助孵化可以促进胚胎种植的原因可能有3个方面：①辅助孵化可帮助胚胎克服孵化前的机械性阻力；②辅助孵化可以降低由活力较差胚胎发育而成的囊胚在扩张和孵化过程中所消耗的能量阈值；③体外培养的胚胎发育落后于体内发育，而超排卵子治疗周期子宫内膜接受胚胎着床的“窗口”早于自然周期，辅助孵化有利于调整两者的时间差，使胚胎发育和子宫内膜尽可能达到同步[8-9]。目前，大多数观点认为激光辅助孵化方法简便、快速、安全、可以广泛使用。

1995年Germond等初次运用[10]1.48μｍ非接触式激光在鼠胚透明带上打孔，建立了安全并有效的胚胎ＡＨ程序，随后很多研究也证实了激光法是一种安全有效、操作简便的ＡＨ方法。激光辅助孵化主要有透明带打孔及透明带薄化。目前文献报道认为激光透明带薄化较理想的区域为：深度应达致密层, 约相当于透明带厚度的50%～80%, 宽度约相当于总透明带1/ 4周长（80 μm）。

本次研究表明激光辅助孵化技术（LAH）可以提高透明带异常患者的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率且未增加流产率、畸形率等不良结局风险。提示该LAH程序用于透明带异常患者的辅助孵化是安全的、有效的。但本研究存在临床样本量小的特点，未来需要加大样本量，加强研究，以进一步了解辅助孵化与临床结局（胚胎种植率、临床妊娠率、活产率）的关系，进而为广大高龄妇女和妊娠结局不良的患者带来福音。

参考文献：

[1]王雪改.激光辅助孵化对冻融胚胎种植成功率及母体并发症的影响[J].实用医技杂志,2020,27(06):746-747.

[2]薛林涛,王世凯,覃捷,李政达,周亭亭,毛献宝,张小慧,韦娉嫔,刘庆友,谭卫红.透明带激光操作对玻璃化冻融囊胚复苏及孵出动态模式的影响[J].生殖医学杂志,2019,28(11):1340-1345.

[3]王慧,狄春光,王功发,王毅,丁洁,王丽萍.机械辅助孵化和激光辅助孵化对冻融卵裂期胚胎移植临床妊娠结局的影响[J].中国优生与遗传杂志,2019,27(10):1260-1261+1278.

[4]史鸿志,秦妍,张楠,宋琪,李伟伟,殷秀荣.激光辅助孵化对玻璃化冷冻的卵裂期胚胎妊娠结局的影响[J].中国优生与遗传杂志,2019,27(08):1000-1001+1006.

[5]激光辅助孵化对多囊卵巢综合征患者体外受精-胚胎移植治疗结局的影响分析[J]. 彭姝明,刘海鹏,陈艺,贺平,杨帆. 生殖医学杂志. 2016(05)

[6]Use of imaging software for assessment of the associations among zona pellucida thickness variation, assisted hatching, and implantation of day 3 embryos[J] . Erin I. Lewis,Reza Farhadifar,Leslie V. Farland,Daniel J. Needleman,Stacey A. Missmer,Catherine Racowsky. Journal of Assisted Reproduction and Genetics . 2017 (10)

[7]Laser-assisted hatching of human embryos: may two alternative approaches (thinning versus drilling) impact on implant rate?[J] . Francesco Padula,Stella Capriglione,Paola Iaconianni,Simona Gatti,Assunta Lippa,Salvatrice Elisa Minutolo,Diana Giannarelli,Claudio Giorlandino. Lasers in Medical Science . 2017 (7)

[8]No adverse effects were identified on the perinatal outcomes after laser-assisted hatching treatment[J] . Hanying Zhou,Wanqiu Zao,Wei Zhang,Juanzi Shi,Wenhao Shi. Reproductive BioMedicine Online . 2014

[9]Laser-assisted hatching improves clinical outcomes of vitrified–warmed blastocysts developed from low-grade cleavage-stage embryos: a prospective randomized study[J] . Cai-Yun Wan,Cheng Song,Liang-Hui Diao,Guan-Gui Li,Zhong-Jian Bao,Xiao-Dong Hu,Hong-Zhan Zhang,Yong Zeng. Reproductive BioMedicine Online . 2014

[10]Germond M，Nocera D，Senn A，et al．Improved fertilizatzation and implantation ratas after non-touch zona pellucida microdrilling of mouse oocytes with a 1.48μｍ diode laser beam[J].Hum Reprod，1996，11（5）：1043～1048．