循环外泌体抑制弥漫大 B细胞淋巴瘤细胞增殖及其可能机制研究

循环外泌体抑制弥漫大 B细胞淋巴瘤细胞增殖及其可能机制研究

王鑫

黑龙江农垦总局总医院 黑龙江哈尔滨 150088

【摘要】目的：研究弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖经循环外泌体干预的影响及可能的抑制机制。方法：将2018年5月-2020年5月期间我院收治的18例弥漫大B细胞淋巴瘤患者设为观察组，将同期18例体检健康者设为对照组，从两组人群中分离血浆外泌体，分别对淋巴瘤细胞进行干预，观察并对比淋巴瘤细胞增殖情况及血浆外泌体内、经血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞内miR-92b的表达水平。结果：未经两组人群血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞OD值差异无明显统计学意义（P＞0.05），经观察组人群血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞OD值高于对照组，数据差异有统计学意义（P＜0.05）；观察组群血浆外泌体中、经观察组人群血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞中miR-92b表达水平均低于对照组，数据差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：健康人群的血浆外泌体可通过介导miR-92b抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖。

【关键词】循环外泌体；弥漫大B细胞淋巴瘤；细胞增殖；抑制机制

弥漫大B细胞淋巴瘤是具备侵袭性与中高度恶性的淋巴瘤种类，致死率极高。近年来恶性肿瘤治疗方法的不断拓展，使得该病死亡率得到一定控制，但仍有30%的患者治疗无效死亡^[1]。因此，研究弥漫大B细胞淋巴瘤恶性生物学行为中分子调控机制，为临床治疗提供新的策略已成为诸多学者的重点研究课题^[2]。当前已有研究报道循环外泌体对于肿瘤细胞增殖具有抑制作用，但目前关于循环外泌体对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞作用的报道相对较少^[3]。为此，本研究以我院患者为例展开相应实验，旨在弥补研究空白，有报道见下。

1 资料和方法

1. 1. 资料

将2018年5月-2020年5月期间我院收治的18例弥漫大B细胞淋巴瘤患者设为观察组，将同期18例体检健康者设为对照组，其中对照组男11例，女7例，年龄39~77岁，平均（55.69±4.08）岁；观察组男13例，女5例，年龄37~72岁，平均（56.37±4.16）岁，两组资料差异无统计学意义（P＞0.05）。

1. 2. 研法

分别采集两组人群抗凝血，离心后保留血浆，按照外泌体提取试剂盒说明书提取血浆外泌体，与保存于-80℃冰箱中。将U2932细胞进行培养，取5代细胞进行实验，以胰酶消化并接种于96孔板，6×10³个细胞/孔。待细胞生长至贴壁，饥饿24h使其同步化。于各孔中加入血浆外泌体，每组设3个复孔。将细胞置于5% CO₂、37℃环境的孵育箱中培养，6、12、24、48h后加入20μL MTT液。待最后一次加入后继续孵育4h，弃上清，将150μL二甲基亚砜滴入各孔，震荡96孔板，10min后以酶标仪于490nm波长处测定光密度（OD）值。

提出各组细胞总RNA，将总RNA按照逆转录试剂盒说明书转录呈cDNA，再以其为模板进行扩增，随后进行聚合酶链反应（PCR），miR-92b上游引物5’-GGGGCAGTTATTGCACTTGTC-3’，下游引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3’，以GAPDH为内参。PCR反应条件：95℃ 10min,95℃ 15s，60℃ 60s，进行40个循环，以2^-△△Cr法计算外泌体中miR-92b表达水平。

经观察组人群血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞中miR-92b的测量方法基本同细胞增殖能力测定，只需将各组细胞同步化完成后加入的循环外泌体改为miR-92b mimic即可，最后测定各孔OD值。

1. 3. 统计学方法

将计量单位（淋巴瘤细胞OD值、miR-92b表达水平）录入SPSS17.0软件，以“ ”表示，t检验，P＜0.05表示数据差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血浆外泌体对淋巴瘤细胞增殖影响分析

未经两组血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞OD值差异无明显统计学意义（P＞0.05），经观察组血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞OD值高于对照组，数据差异有统计学意义（P＜0.05），见表1：

表1 两组血浆外泌体对淋巴瘤细胞增殖影响分析（）

2.2 两组血浆外泌体中miR-92b的表达情况分析

观察组血浆外泌体中miR-92b表达水平为（3.49±0.92），对照组人群血浆外泌体中miR-92b表达水平为（7.22±1.37），观察组血浆外泌体中miR-92b表达水平低于对照组（t=15.496，P=0.001），数据差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 两组血浆外泌体对淋巴瘤细胞中miR-92b的表达影响分析

经观察组血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞中miR-92b表达水平为（1.49±0.33），经对照组血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞中miR-92b表达水平为（0.36±0.09），经观察组血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞中miR-92b表达水平低于对照组（t=22.648，P=0.001），数据差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

外泌体是广泛存在于人体体液中的微小囊泡，其参与细胞间通讯过程，目前被认为与多种恶性肿瘤的发展过程密切相关^[4]。张淑贤^[5]认为外泌体对于人淋巴瘤细胞恶性生物学行为具备抑制效用，为进一步验证此结论，本研究以我院收治的弥漫大B细胞淋巴瘤患者患者为例展开实验。

研究结果显示，未经两组人群血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞OD值差异无明显统计学意义（P＞0.05），经观察组人群血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞OD值高于对照组，数据差异有统计学意义（P＜0.05），这提示健康人群分离的血浆外泌体对于淋巴瘤细胞具有抑制作用，而患者血浆外泌体缺乏这种作用。

进一步分析血浆外泌体对淋巴瘤细胞增殖的抑制机制，本研究选择miR-9b基因作为观测目标。梁艳丽[6]的研究中对正常人群及淋巴瘤患者血浆外泌中差异表达的miRNA进行了筛选，其发现miR-92b在46种miRNA中变化最为明显。本研究以此为基准进行实验，结果显示，观察组群血浆外泌体中、经观察组人群血浆外泌体干预的淋巴瘤细胞中miR-92b表达水平均低于对照组，数据差异有统计学意义（P＜0.05），这说明正常人群与淋巴瘤患者血浆外泌体中miR-9b表达水平差异极大，而在血浆外泌体影响下，相应癌细胞中miR-9b水平亦出现明显差异，提示血浆外泌体极有可能是通过介导miR-9b抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖。

综上所述，健康人群的血浆外泌体可抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖，而弥漫大B细胞淋巴瘤患者的血浆外泌体无此效用，这与患者外泌体中miR-9b这一基因表达减少有关。

参考文献

1. 王静书,李俊杰,赵兵.老年弥漫大B细胞淋巴瘤患者的临床特征及预后分析[J].新疆医科大学学报,2019,42(12):1610-1614.

2. 梁艳丽,李娟,李凤,等.循环外泌体抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖及其可能机制研究[J].生物医学工程与临床,2019,23(01):79-86.

3. 王妃菲,张宇,吴筱莲.血清外泌体miR-92a在弥漫大B细胞淋巴瘤康艾注射液联合化疗治疗监测中的临床意义[J].中国现代医生,2019,57(30):42-45,封3.

4. 曹迪,蒋昱,冯钰, 等.血清外泌体miR-451a在弥漫大B细胞淋巴瘤治疗监测中的意义[J].四川大学学报（医学版）,2018,49(3):399-403.

5. 张淑贤,许壁榆,菅成莲, 等.淋巴瘤细胞来源性的外泌体对人淋巴瘤细胞恶性生物学行为的影响[J].肿瘤,2019,39(6):427-438.

6. 林晓骥,方玮玥,董玉青, 等.miR-148b参与调控弥漫性大B细胞淋巴瘤药物敏感性的机制[J].温州医科大学学报,2020,50(1):12-18.