PCDH10基因在子宫内膜异位症 中的表达特征及临床意义

PCDH10基因在子宫内膜异位症 中的表达特征及临床意义

江曼 1 ，田晓蕾 *，罗霸根 2

（南方科技大学 医院 妇产科 广东 深圳 518051 ）

【摘要】目的：探讨PCDH10在子宫内膜异位症组织中的表达特征，为子宫内膜异位症的早期诊断和治疗提供新的参考指标。方法：收集2019年1月 到2019年12月期间在我院妇产科进行手术治疗的子宫内膜异位症患者，其中病理确诊为子宫内膜异位症患者的异位内膜（20例），另外取子宫肌瘤患者和子宫脱垂患者切除的正常子宫内膜组织20例作为对照组，收集其冰冻标本和石蜡包块。利用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术检测子宫内膜异位症组织中异位内膜和正常子宫内膜组织中PCDH10的表达特征。结果：对照组正常子宫内膜组织PCDH10基因高表达，子宫内膜异位症异位内膜组织中PCDH10表达沉默。结论：PCDH10基因在子宫内膜异位症组织中低表达，具有抑制子宫内膜异位症发病的作用。

【关键词】PCDH10；子宫内膜异位症；表达特征；临床意义

The Expression and Clinical Significance of PCDH10 Gene in Endometriosis

JIANG Man TIAN Xiaolei* LUO Bagen

（Southern University of Science and Technology Hospital, Shenzhen 518051, China）

【Abstract】 Objective:To explore PCDH10 expression in endometriosis, providing reference index for early diagnosis and treatment of it. Methods: We collected frozen specimens and paraffin blocksthe, the clinical data of each 20 cases endometrial tissue from January 2019 to December 2019 are used to make the surgery. By RT-PCR and real-time PCR method to detecte the PCDH10 mRNA expression in endometriosis and normal endometrial tissue. Result: PCDH10 gene in normal endometrial tissue is highly expressed ,in contrast,in endometriosis tissue were expressed silencely. Conclusion: PCDH10 gene play an important role in endometriosis. It express in endometriosis lowly so it may inhibitate the endometriosis.

【Key words】PCDH10; endometriosis; expression; clinical significance

子宫内膜异位症（endometriosis, EMS）是子宫内膜腺体和基质种植于子宫以外的一种雌激素依赖性疾病。异位的子宫内膜，绝大多数位于盆腔内的卵巢、宫底韧带、子宫下部内壁浆膜面、子宫直肠陷凹、乙状结肠的腹膜面和阴道直肠隔等。在育龄期妇女，EMS发病率约为10%-20%^[1]。目前认为EMS的发病机制的主要研究包括：经血逆流学说、体腔上皮化生学说、遗传免疫学说、淋巴及静脉播散学说、黄素化未破裂卵泡综合征学说等^[2,3]。具体发病机制尚不十分清楚，治疗方法仍较局限且治疗结果并不十分满意。原钙粘蛋白10(PCDH10)属于钙粘蛋白超家族，是一种表达于细胞膜表面的钙粘附蛋白。最近研究还发现PCDH10还是多个癌症的重要抑癌基因，国外已有研究表明它在淋巴瘤、髓母细胞瘤、宫颈癌、鼻咽癌、胃癌、肝细胞癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌中均表达下调甚至失活^[4-11] 。之前已有研究发现PCDH10基因在子宫内膜腺样癌细胞中低表达，是子宫内膜腺样癌的抑癌基因^[12]。我们大胆推测这种作用机制可能在子宫内膜相关疾病中具有普遍性，然而，关于PCDH10在子宫内膜异位症的表达情况尚未有报道。因此，我们对子宫内膜异位症中PCDH10的表达进行探究，以期待对子宫内膜异位症患者的早期诊断和临床治疗提供进一步的参考标指标。

1 材料与方法

1. 1. 主要试剂与材料

小号提质粒提取试剂盒（天根生物有限公司生产）、总 RNA 提取试剂盒 (天根生物有限公司生产)；KOD SYBR qPCR Mix 试剂（TOYOBO，日本产）；M-MLV (Invitrogen)逆转录试剂盒。

高速冷冻离心机：德国Eppendoff 公司；PCR 仪器：美国 BIO-RAD 公司；实时荧光定量 PCR 仪器：美国 Applied Biosystems 公司。

1.2 标本来源

收集 2019 年1 月至2019 年 12 月期间在南方科技大学医院妇产科住院进行手术治疗的子宫内膜异位症患者，其中病理确诊为子宫内膜异位症患者的异位内膜（20例），另取子宫肌瘤患者和子宫脱垂患者切除的正常子宫内膜组织20例作为对照组，收集冰冻标本和石蜡包块标本。其中子宫内膜异位症组20例，年龄20-50岁，平均 36.7 岁，均经病理切片证实为子宫内膜异位症组织。根据1997年由美国生育协会（AFS）提出的“修正子宫内膜异位症分期法”（rAFS分期）把子宫内膜异位症分为I、II、III、IV期 ：其中rAFS I-II期手术治疗患者共18例，rAFS III-IV期手术治疗患者2 例。另正常子宫内膜组织共20例，年龄区间30-55岁，平均 45.6岁，均经腹腔镜或开腹手术子宫切除切术后取子宫内膜经病理诊断证实为正常子宫内膜组织。所有标本均在手术结束后 0.5-1 h 内取下，并快速放置于液氮灌中，编号登记完毕后放置于 -80℃超低温冰箱中储存。

1.3 实验方法

1.3.1 提取和逆转录子宫内膜组织RNA

将实验样本从 -80℃超低温冰箱中取出，将子宫内膜异位症组织和正常子宫内膜组织分别在液氮中研磨成粉末状。采用总RNA提取试剂盒(天根生物有限公司生产)，提取后用紫外分光光度仪器检查 DNA 的浓度和纯度，再用琼脂糖凝胶电泳检查其完整性。并参照M-MLV (Invitrogen)逆转录试剂盒说明书将 提取的RNA 逆转录成 cDNA。

1.3.2 PCDH10基因在子宫内膜组织中mRNA 表达的检测

将逆转录的异位子宫内膜组织和正常子宫内膜组织cDNA分别进行RT-PCR和实时荧光定量PCR（real-time PCR）。PCR 总反应体系为 25μL，反应条件：95℃ 2min，1 个循环。95℃ 30s，57℃ 30s(内参GAPDH为 58℃)，72℃ 30s，35个循环，最后 70℃延伸 5 min。PCR 产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳。

实时荧光定量PCR反应体系为25ul,反应条件按KOD SYBR qPCR Mix试剂（TOYOBO，日本产）说明书操作。含特异性上下游引物各4pmol，目的基因PCDH10及内参照GAPDH的引物由北京奥克鼎盛生物公司合成。PCDH10基因qPCR 反应条件: 95 °10 min,1个循环; 95°30 s, 58° 30s, 70°30s, 40个循环; 再将温度降至60℃采集荧光。整个实验操作流程在ABI仪上进行，每个样本重复3次，每次所检测的Ct值取平均值，通过测定目的基因和内参的Ct值来计算各自mRNA的表达变化。PCDH10 及内参GAPDH基因的引物序列如表 1 所示。

1.4 统计学分析

数据以χ±s 表示，将所需数据应用 SPSS19.0 软件进行处理，计数资料用χ²检验或四格表精确检验，计量资料用t 检验或方差分析，检验显著性水准取α=0.05。

2 结果

2.1 PCDH10在子宫内膜组织中的表达特征

通过半定量RT-PCR我们检测得出，PCDH10在20例正常子宫内膜组织中表达增高，而在18例子宫内膜异位症（I、II期）组织和2例子宫内膜异位症（III、IV期）组织中表达沉默（图1）。

1 2 3 4 5 6 7 8

PCDH10(235bp)

1 2 3 4 5 6 7 8

GAPDH(241bp) 图1

1-4：正常子宫内膜组织；5-6：子宫内膜异位症组织（I、II期）；7-8：子宫内膜异位症组织（III、IV期）

图1 RT-PCR检测PCDH10在子宫内膜组织中表达情况

2.2 PCDH10 mRNA在正常子宫内膜和子宫内膜异位症组织中表达特征

进一步通过实时荧光定量PCR技术检测PCDH10 mRNA在20例子宫内膜异位症组织及20例正常子宫内膜组织中的表达特征。结果显示，子宫内膜异位症组织中PCDH10表达明显低于正常子宫内膜组织,P＜0.05，差异有统计学意义（图2）。与半定量RT-PCR检测结果相一致。

图2

图2 real-time PCR检测PCDH10在子宫内膜组织中表达情况（NE：正常子宫内膜组织；EMS：子宫内膜异位症组织）

3 结论

PCDH10基因在子宫内膜异位症组织中低表达，具有抑制子宫内膜异位症发病的作用。

4 讨论

原钙粘蛋白10(PCDH10)由胞膜外、跨膜区和胞浆内三个部分组成，其胞浆内肽链多变，可以与不同的蛋白结合，主要参与钙依赖性细胞链接。最初发现它在动物胚胎中枢神经发育过程发挥重要作用，尤其是介导神经突触的形成。已有研究发现PCDH10基因是多个癌症的重要抑癌基因，证实了PCDH10在这些肿瘤中表达失活是由于其启动子区DNA甲基化所致，并且这种DNA甲基化介导的PCDH10表达沉默上述肿瘤临床标本和癌细胞系中十分常见，却未见于正常组织中。因此，PCDH10甲基化状态在临床上可以作为肿瘤诊断、化疗指标，也可作为判断预后情况的标志。但目前尚且未有关于PCDH10对子宫内膜异位症发病作用的相关报道。于是，本研究探索PCDH10在子宫内膜异位症组织中的表达特征。通过研究，我们发现PCDH10在子宫内膜异位症组织中较正常子宫内膜组织表达沉默，进而推测，PCDH10是子宫内膜异位症发病的抑制基因。

综上所述，我们得出结论：PCDH10基因在子宫内膜异位症的发生发展中有着重要的抑制作用；它在子宫内膜异位症组织中低表达，有类似于抑癌基因的作用。以上的实验结果将为我们进行后续的实验研究奠定基础，同时将在后续的研究中加以完善。我们下一步拟行PCDH10基因对子宫内膜异位症细胞生物学活性的影响及相关机制的研究，从而更好地、更加准确地判断PCDH10在子宫内膜异位症发病中的作用及相关机制，争取为早期子宫内膜异位症的诊断和临床治疗提供新的参考指标。

参考文献：

1. Balkowiec M, Maksym RB, Wlodarski PK. The bimodal role of matrix metalloproteinases and their inhibitors in etiology and pathogensis of endometriosis (reciew)[J]. Mol Med Rep, 2018, 18(3):3123-3136.

2. Garavaglia E, Sigismondi C, Ferrari S, et al. The origin of endometriosis-asssociated ovarian cancer from uterine neoplastic lesions[J]. Med Hypotheses, 2018, 110:80-82.

3. Taylor RN, Kane MA, Sidell N. Pathogenesis of endometriosis: roles of retinoids and inflammatory pathways[J]. Semin Reprod Med,2015, 33(4): 246-256.

4. Wentao Liu, Jin Wu, Guangyue Shi, et al. Aberrant promoter methylation of PCDH10 as a potential diagnostic and prognostic biomarker for patients with breast cancer[J]. Oncol Lett. 2018 Oct;16 (4), 4462-4470.

5. Jingyu Deng , Han Liang , Guoguang Ying, et al. Clinical Significance of the methylated cytosine-phosphate-guanine sites of protocadherin-10 promoter for evaluating the prognosis of gastric cancer. J Am Coll Surg. 2014 Nov;219 (5):904-13.

6. Maria Cristina Curia1 , Fabiana Fantini1 , Rossano Lattanzio1, et al. High methylation levels of PCDH10 predict poor prognosis in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. BMC Cancer. 2019 May;19 (1):452.

7. Bertrand KC, Mack SC, Northcott PA, et al. PCDH10 is a candidate tumour suppressor gene in medulloblastoma. Childs Nerv Syst. 2011 Aug;27(8):1243-9.

8. Ying J, Li H, Seng TJ, et al. Functional epigenetics identifies a protocadherin PCDH10 as a candidate tumor suppressor for nasopharyngeal, esophageal and multiple other carcinomas with frequent methylation. Oncogene. 2006 Feb 16;25(7):1070-80.

9. Li Z, Chim JC, Yang M, et al. Role of PCDH10 and its hypermethylation in human gastric cancer. Biochimica et biophysica acta. 2011 Feb;1823(2):298-305.

10. Mingxin Ye, Jinzheng Li, Jianping Gong . PCDH10 gene inhibits cell proliferation and induces cell apoptosis by inhibiting the PI3K/Akt signaling pathway in hepatocellular carcinoma cells. Oncol Rep. 2017 Jun;37 (6), 3167-3174.

11. Narayan G, Scotto L, Neelakantan V,et al. Protocadherin PCDH10, involved in tumor progression, is a frequent and early target of promoter hypermethylation in cervical cancer. Genes, chromosomes & cancer. 2009 Nov;48(11):983-92.

12. 江曼，叶元，杨一华.PCDH10基因对子宫内膜腺样癌细胞抑制作用的研究.实用医学杂志，2015(31)04,526-528.

作者资料：江曼、南方科技大学医院、深圳、518051、广东省深圳市南山区留仙大道2051号妇产科。收件人：江曼，邮编：518051，电话：18680534798。

作者简介：江曼，(1988-)，性别女，湖北省黄冈市(籍贯)，主治医师，硕士(学历)，研究方向：妇科肿瘤。

通讯作者简介：田晓蕾，(1982-)，性别女，辽宁省(籍贯)，副主任医师，硕士(学历)，研究方向：妇科肿瘤。