不同产地半枝莲指纹图谱及聚类分析整体质量评价

不同产地半枝莲指纹图谱及聚类分析整体质量评价

张建文 窦锦明 1*

潍坊市中医院，山东 潍坊 261031

[摘要] 目的：整体评价不同产地半枝莲质量。方法：采用反相高效色谱柱及二极管阵列检测器联用技术，建立半枝莲指纹图谱；以共有峰面积为指标，运用SPSS 24软件，对半枝莲进行聚类分析。结果：指纹图谱获得20个共有峰，各产地半枝莲相似度均大于0.78；各产地半枝莲可聚为2大类，第Ⅱ类又可聚为4类（河南、陕西、四川、广西）。结论：该方法可用于半枝莲整体质量控制。

[关键词] 半枝莲 指纹图谱 聚类分析 质量评价

Fingerprint and Cluster Analysis of Scutellaria barbata from Different Origins

Zhang Jianwen Dou Jinming

(Weifang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shandong Weifang 261031)

[Abstract] Objective: To evaluate the quality of Scutellaria barbata from different habitats as a whole. Methods: The fingerprint of Scutellaria barbata was established by using reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPC) column and diode array detector (DAD), and clustering analysis of Scutellaria barbata was carried out by SPSS 25 software with the common peak area as the ind¹ex. Results: Twenty common peaks were obtained by fingerprint, and the similarity of Scutellaria barbata from different habitats was greater than 0.75. Scutellaria barbata from different habitats could be pided into two categories and four sub-categories (four main habitats). Condlusion: The method can be used for the quality control of Scutellaria barbata.

Quality Evaluation of Cluster Analysis of Scutellaria barbata Fingerprint

[Keywords] Scutellaria barbata D.Don；Fingerprints；cluster analysis； Quality evaluation

半枝莲Scutellaria barbata D.Don为唇形科黄芩属植物半枝莲的全草；辛、苦、寒，归肺、肝、肾经；清热解毒，化瘀利尿^[1]。含有黄酮类、二萜类、芳香酮、芳香酸类等。具有抗肿瘤^[2]、抗突变、抗氧化等药理作用。半枝莲产地广泛（河南、陕西、四川、广西等），药材受地理、环境等因素影响，质量参差不齐。本研究用指纹图谱进行相似度评价，用聚类分析法对共有峰处理，整体评价半枝莲质量。该方法稳定、可行，能用于半枝莲整体质量控制。

1材料

高效液相色谱仪（岛津LC-20AT、SPD-M20A）、甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱级）、半枝莲（中国食品药品检定研究院，批号：121293-201404）、娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

半枝莲通过康美中药城、中药材天地网、数字本草购买（S1河南省驻马店市确山县石滚河镇、S2河南省周口市商水县姚集镇、S3河南省南阳市社旗县赊店镇、S4广西省钦州市灵山县石塘镇、S5广西省玉林市博白县永安镇、S6广西省贵港市港南区木梓镇、S7四川省攀枝花市米易县白马镇、S8四川省绵阳市盐亭县云溪镇、S9四川省成都市双流县彭镇、S10陕西省商洛市柞水县凤凰镇、S11陕西省商洛市丹凤县棣花镇、S12陕西安康市旬阳县吕河镇），经潍坊市中医院王修斌主任中药师鉴定均为唇形科黄芩属植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的干燥地上部分。

2方法

2.1色谱条件

色谱柱：Inertsustain C18（250mm4.6um，5um）；流动相：甲醇A-0.1%磷酸B，梯度洗脱，时间/A：0min/10%，5min/28%，20 min/30%，45 min /50%，60min /60%，70 min /65%；流速：1.0mL/min；波长：254nm；柱温：30℃；进样量：1.0μL；

2.2溶液制备

精密称取半枝莲对照药材、各产地药材粉末（过三号筛）1.0g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇50mL，超声（500W、60kHZ）30min，放冷，过滤，即得。

2.3方法学考察

2.3.1精密度试验

取2.2项下半枝莲对照药材溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次。各共有峰相对保留时间RSD为0.72~1.59%，表明仪器精密度良好^[3]。

2.3.2重复性试验

按照2.2项下制备方法，制备6分对照药材溶液，按2.1项下色谱条件进样，各共有峰相对保留时间RSD为0.35~1.67%，表明方法重复性良好^[3]。

2.3.3稳定性试验

取2.2项下半枝莲对照药材溶液，按2.1项下色谱条件，分别于0.1.2.4.8.16.24h进样，各共有峰相对保留时间RSD为0.82~1.26%，表明样品溶液在24h内稳定^[3]。

2.4半枝莲指纹图谱建立

精密称取12份不同产地半枝莲样品，按2.2项下方法制备供试液，按2.1项下色谱条件进样，建立指纹图谱。经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统V2.0（2012.130723版）》处理，采用多点校正，全色谱峰匹配，时间窗宽度0.1，生成对照谱图R，29.363min处峰为参考峰，标记为*。获得20个共有色谱峰，对12份不同产地半枝莲进行相似度评价^[4]。

2.5聚类分析评价

使用SPSS 24软件，以20个共有峰的峰面积为变量，选择系统聚类法，对数据进行聚类分析。

3结果与讨论

3.1半枝莲指纹图谱相似性评价结果

不同产地半枝莲指纹图谱见图1。经相似度评价系统处理不同产地半枝莲相似度结果见下表1。S7四川攀枝花产区第5~20min大极性成分色谱峰与其他产地有差异，相似度为0.786，可能与其处于高海拔相关。

表1 不同产地半枝莲指纹图谱相似度

图1 不同产地半枝莲指纹图谱

本实验提取溶剂分别考察了石油醚60~90℃、氯仿、甲醇，以总峰面积为指标，结果甲醇提取的效果最好。用SPD-M20A检测器对各色谱峰的最大吸收波长比较，210nm波长30min后基线漂移严重；235nm、280nm波长各峰吸收小；300nm、335nm波长50min之后吸收峰少；254nm为确定波长，各洗脱时间段出峰均匀，峰高落差小，。

3.2半枝莲指纹图谱聚类分析评价结果

以12个产地半枝莲共有峰峰面积为指标，采用系统聚类分析法对不同产地半枝莲进行聚类分析，可聚为两大类：第Ⅰ类（S7四川攀枝花——盆地边缘高海拔区产地）；第二类Ⅱ（其余产地——低海拔区产区），又进一步聚为中纬度产区类——（S1、S2、S3河南）（S10、S11、S12陕西）和低纬度产区类——（S4、S5、S6广西）（S8、S9四川），结果见图 2。

S7四川攀枝花产区归为第Ⅰ类，与相似度评价结果相一致，可能是该产区位于四川盆地的边缘山地区，海拔平均2500米，自然条件与其他4个主产区的差异大，半枝莲物种有变异。

虽然S1、S2、S3河南和S10、S11、S12陕西产地均位于北纬33°~35°之间，属于温带季风气候和亚热带季风气候过度区，自然条件相似，但陕西产区位于秦岭山脉南麓，平均海拔1000米，河南产区位于豫东平原平均海拔300米，半枝莲物种虽然有变异——经系统聚类分析可聚两类，但物种亲缘关系仍然较近——经系统聚类分析可聚入中纬度产区类。

虽然S4、S5、S6广西和S8、S9四川产地的半枝莲经系统聚类分析可聚入低纬度产区类，但是广西产地和四川产地又可再聚为两类，可能是广西产地位于北纬20°~23°之间，属于亚热带季风气候区，海拔500米以下，以平原为主；而S8、S9四川产区位于北纬26°~29°之间，属于亚热带季风气候、高原山地气候区，海拔平均1500米，位于四川盆地底部，自然条件有差异，物种有一定变异。

图2 不同产地半枝莲指纹图谱聚类分析结果

4结论

通过指纹图谱和聚类分析联合应用于半枝莲质量评价^[5]，不同产地半枝莲指纹图谱分析确定共有峰20个，但4个产区共有峰峰面积相差较大；聚类分析可聚为2大类、第Ⅱ类又可聚为4类（河南、陕西、四川、广西），说明该方法稳定性好、专属性强，可用于半枝莲整体质量控制。

［参考文献］

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部［S］.北京: 中国医药科技出版社,2015: 118-119．

[2]陈功森,罗菊元,尹兴斌,等. 中药半枝莲抗肿瘤研究文献分析[J]. 中华中医药杂志,2019,34（8）：2771-2773

[3]国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)[S]. 2001.

[4]游景瑞,熊丹丹,刘春花,等. HPLC结合化学计量学法的毛大丁草指纹图谱研究[J].中药材,2019，42(1):126-131.

[5]李强,杜思邈,张忠亮,等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J]. 中草药,2019,50(17): 3095-3104.

1潍坊市中医药科技计划项目(2016-3-010)：半枝莲黄酮类成分提取分离纯化及体外抗肿瘤活性研究

潍坊市中医药科技计划项目(2019-4-092)：基于网络药理学半枝莲抗肿瘤有效成分研究

^*通讯作者：窦锦明，研究方向：抗肿瘤中药药效物质基础与作用机制研究