海带粉对乳腺增生模型小鼠血清激素水平的影响

海带粉对乳腺增生模型小鼠血清激素水平的影响

王婷 1 王燕菁 2 曾旭 3 蒋雯 4 李文凯 5 蒋银燕 *

1.长沙医学院 2018级本科临床医学 9班 湖南 长沙 410219

摘要 目的：观察海带粉对乳腺增生症（Hyperplasia of mammary gland， HMG)小鼠血清激素的影响。方法：采用注射苯甲酸雌二醇、黄体酮建立小鼠HMG模型，将造模成功的小鼠随机分为5组，即正常组、模型组、海带粉低、中、高剂量组，给药30天后，测量各组小鼠同侧第2对乳头的高度及直径；HE染色观察各组小鼠乳腺组织变化;采用酶联免疫吸附（ELISA)法检测血清雌二醇（Estradiol2，E₂)、孕酮（Progesterone，P)和促乳素（Prolactin，PRL)、组织血管内皮生长因子（VEGF)的含量。结果：与正常组比较，模型组小鼠乳头直径、乳头高度增加（P<0.05)，模型组小鼠乳腺组织中腺泡数目增多,腺泡和导管增生、扩张,细胞排列紊乱，表现出典型的乳腺增生症状。与模型组比较，各给药组乳房直径、乳头高度降低(P<0.05)，海带粉各剂量组小鼠乳腺增生小叶和腺泡数量减少，血清E₂、PRL、VEGF含量降低，P含量升高（P<0.05)，海带粉高剂量组乳房直径减小（P<0.05)，海带粉各剂量组E₂、PRL、P含量及VEGF含量差异无统计学意义。结论：海带粉能减轻HMG发展，其作用与降低小鼠血清E2、PRL、VEGF以及升高P含量有关，可能与通过下调VEGF等途径促进细胞凋亡有关。

关键词 海带粉；乳腺增生症（HMG)；雌激素；细胞凋亡；动物实验；小鼠

乳腺增生症(Hyperplasia of mammary gland, HMG)是临床上常见的妇科疾病，也是乳腺癌的主要诱发因素^[1]。随着生活环境改变及生活节奏的加快，HMG发病率逐年升高，已对女性患者身心健康造成严重影响^[2]。目前临床上对HMG还没有一种适用性广且疗效肯定的治疗方案，且其发病机理尚不明确，因此对其机理和治疗进行研究非常必要。目前中西医结合临床治疗HMG得到广泛应用，有学者研究发现，海藻可能对乳腺增生有一定的作用，但属海藻褐藻门，来源丰富,价格低廉,作为药食同源品的海带对乳腺增生的影响尚未有结论。且国内外尚没有专门用海带粉探究其对乳腺增生模型小鼠血清激素水平的影响的研究或实验。因此本实验以小鼠为研究对象，建立乳腺增生模型，探究海带粉对乳腺增生模型小鼠血清激素水平的影响，为乳腺增生治疗提供一定的理论依据。。故本研究利用小鼠HMG模型，观察海带粉治疗HMG作用机制，为其临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级SD雌性未孕小鼠50只，体质量(103.58±6.78)g，购自长沙医学院实验动物中心，实验室室温控制在(22±3)°C，相对湿度45%~55%，动物自由饮水，适应性饲养1周后开始实验。

1.2试剂及药品他莫昔芬片(批号20180506)，辽宁一成药业有限公司。苯甲酸雌二醇注射液(批号161109)，广州白云山明兴制药有限公司。黄体酮注射液(批号170111)，浙江仙琚制药股份有限公司。血清雌二醇(Estradiol，E₂₎试剂盒，货号：A001-3；孕酮(Progesterone，P)试剂盒，货号：A001-3；以上两检测盒均购于上海酶联生物科技有限公司。海带粉处方浸提液由长沙医学院附属第一医院制备，海带粉处方(中药饮片)纯净水浸泡30min，每次加水3L煎煮，共煎煮3次，将3次煎煮液合并后浓缩，最终制成含生药3g/L的浸提液，-4℃保存备用，灌胃给药剂量按照临床用量10倍给药，每天1次。其余试剂均为国产分析纯。

1.3主要仪器离心机(北京医用离心机厂)；DK-80型电热恒温水浴槽(广东环凯微生物科技有限公司)；W-80A漩涡混合器(上海医大仪器厂)；酶标仪(美国赛默飞舍公司)。

1.4模型制备及动物分组造模，从50只小鼠中随机选取10只作为对照组，其余40只用雌、孕激素序贯法进行造模，按体质量0.5mg/(kg*d)于小鼠后肢后外侧肌肉注射苯甲酸雌二醇，每天1次，左右交替，连续25天，继而腹腔注射黄体酮，4mg/(kg-d)，每天1次，连续5天，在造模过程中每3天测量1次体质量，根据其体质量的变化及时调整给药量，对照组注射等体积的生理盐水，在造模过程中小鼠乳头会出现红肿、增大等情况，且有部分乳晕出现。连续造模过程中，随机分批次共取出造模小鼠10只，麻醉处死并通过乳腺组织病理切片观察乳腺腺泡和导管的增生情况以确定造模成功。造模成功后将剩余40只模型小鼠利用SPSS21.0统计软件生成随机数字随机分为5组。各组受试对象体质量、乳头的肿大程度等基本情况差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.5给药方法模型组和对照组小鼠按药物同体积生理盐水灌胃，海带粉低、中、高剂量组按成人剂量生药提取液同体积的5、10、15倍混悬液灌胃，海带粉低剂量组（含量15%）、中剂量组（含量25%）和高剂量组（含量35%）给药剂量分别为：2.6g/(kg-d)，持续21天。

1.6指标检测方法①利用游标卡尺精确测量小鼠胸部第2对乳头的直径与高度，小鼠乳腺组织病理变化观察末次给药后,脱颈椎处死各组小鼠，取下第2对完整乳房，用10%的甲醛溶液固定并用石蜡包埋，切片，HE染色,光镜观察；②实验结束后，用水合氯醛麻醉动物，并通过心脏采血收集各组小鼠血液，在低温离心机4℃下，以4000r/min离心15min，收集上清液，再用ELISA法测定各组小鼠血清E₂、P和促乳素(Prolactin，PRL)、VEGF的含量。

1.7统计学方法采用SPSS21.0统计软件进行数据处理，服从正态分布的计量资料用(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠乳头直径、高度结果比较见表1。与正常组比较，模型组小鼠乳头高度及直径增高增大(P<0.05)，说明造模成功。当给予药物连续治疗30天后，与模型组比较，海带粉各剂量组乳头高度及直径减小(P<0.05)。与阳性药组比较，海带粉高剂量组乳房直径减小(P<0.05)。

表1各组小鼠乳头直径、高度结果比较(x±s)mm

与正常组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

2.2各组小鼠乳腺组织病理学变化

对照组小鼠乳腺腺泡、小叶少见并散在分布于 脂肪和结缔组织内，导管和腺泡腔基本未见扩张。模型组小鼠乳腺增生病理特征明显，腺泡腔扩张数量增多及小叶增多，间质内脂肪及结缔组织少见，乳腺细胞大多呈不规则排列。与模型组比较，海带粉低、中、高剂量组小鼠乳腺增生情况均有改善，腺泡腔扩张数量减少，导管变窄且上皮增生减轻，见下图1-5。

图1对照组 图2模型组

图3海带粉低剂量组 图4海带粉低剂量组 图5海带粉低剂量组

2.3各组小鼠血清E₂、PRL、P检测结果比较见表2。与对照组比较，模型组E₂、PRL水平升高，P水平降低(P<0.05)。与模型组比较，海带粉各剂量组血清E₂、PRL水平降低，P水平升高(P<0.05)。

表2各组小鼠血清E₂、PRL和P检测结果比较(x土s)pg/mL

与正常组比较，①P<0.05;与模型组比较，②P<0.05

2.4各组小鼠乳腺组织 VEGF 含量测定结果见表。

表2各组小鼠乳腺组织VEGF含量的测定结果(X±s,ng/g)

注：与对照组比较，*P<0.05;与模型组比较，△P<0.05

3讨论

HMG属于中医“乳癖”范畴，特征为经前或经期乳房胀满疼痛，甚则乳房结块^[3]。其致病机理尚不明确，尚无特效治疗方法及药物。有研究^[4]认为HMG的发病原因可能与卵巢功能失调，雌、孕激素水平比例失调有关，E₂及PRL、VEGF水平增高，P水平降低，长期剌激乳腺组织使乳腺导管和小叶增生过度而复旧不全是本病的主要病因，故临床治疗药物的选择靶点主要针对激素水平的调节。临床应用显示局部手术切除也可达到治疗HMG的目的，但患者不易接受，且复发率高^[5]。因此，改变血清雌、孕激素及PRL、VEGF水平，减少乳腺小叶组织对雌、孕激素的反应仍是目前治疗HMG的有效方法^[6]。

本研究采用苯甲酸雌二醇联合黄体酮制备HMG小鼠模型，模型组小鼠乳头直径、乳头高度增加，E₂、PRL、VEGF水平升高，P水平降低，病理切片进一步证实造模成功。课题组人员在给药后检测发现海带粉可以有效抑制HMG小鼠乳头直径的增大以及乳头高度的增加，腺泡腔扩张数量减少，导管变窄且上皮增生减轻。海带属海藻中的褐藻,目前研究发现褐藻中主要的活性成分包括多糖类、蛋白类、萜类、多酚类、氨基酸类，还有多种维生素、矿物质和微量元素，这些活性成分使之具有抗癌、降血压、降血脂、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血等多种生理活性^[7]。海带因其富含褐藻多糖、褐藻多酚以及碘等人体需宜营养成分, 具有抗癌、防癌、降三高、补钙、提高免疫力、皮肤祛皱增白等功效,还是低脂肪、低热量的保健食品。研究显示海带粉作用机制是由于其中含有大量的碘，可以促使卵巢滤泡黄体化，从而降低体内雌激素的水平，使内分泌失调得到调整，最终消除乳腺增生^[8]。另外也可能与降低E₂、PR、VEGF的浓度，升高P的含量有关，该结果进一步提示海带粉与改善机体内环境中的激素水平有关^[9]。雌激素可刺激乳腺导管生长，而P恰能对高雌激素状态产生抑制作用，使垂体和卵巢功能受到影响，从而控制病情的进一步恶化。另外依赖内分泌激素的组织器官在缺乏时可产生细胞凋亡，这种现象同样可发生于肿瘤组织，在雌激素依赖的组织如乳腺，激素可能诱导细胞凋亡，这可能也是其治疗HMG的重要作用机理^[10]。

参考文献

[1]张如霜.触诊联合二维灰阶超声在乳腺疾病普查中的应用价值分析[J].基层医学论坛,2019,23(34):4984-4985.

[2]房涛,惠建荣.“通利枢机针法”结合逍遥丸治疗肝郁气滞型乳腺增生的临床研究[J].陕西中医药大学学报,2019,42(06):96-99+104.

[3]董文启.桂枝茯苓丸内服治疗肝郁肾虚型乳腺增生症的临床疗效[J].黑龙江医药,2019,32(05):1084-1087.

[4]朱丽文,胡韬,张颂文.乳癖散结胶囊联合小剂量他莫昔芬片治疗对乳腺增生患者血清雌、孕激素的影响及疗效分析[J].中外医疗,2019,38(30):112-114.

[5]高琼,王倩.散结膏穴位贴敷治疗乳腺增生临床效果分析[J].四川中医,2019,37(10):173-176.

[6]吴军.手术切除具有癌变性状乳腺增生组织的临床作用分析[J].数理医药学杂志,2019,32(10):1482-1483.

[7]鲁昌盛,鲁昌辉,杨桂美.卡托普利联合他莫昔芬治疗乳腺增生伴高血压的临床疗效及对雌二醇、黄体酮水平的影响[J].中国老年学杂志,2019,39(19):4779-4782.

[8]童玉春,宋捷,江一鸣,项蓉蓉,任瑶,梁文波.乳腺增生病药物治疗机制研究进展[J].药物评价研究,2019,42(10):2106-2110.

[9]吴佳佳,陈家旭,肖飞,裴学军.从“异病同治”探讨小金丹在乳腺增生症的应用[J].世界中医药,2019,14(09):2241-2244.

[10]张松涛.消结安胶囊联合枸橼酸他莫昔芬片对乳腺增生术后性激素水平的影响[J].中国合理用药探索,2019,16(09):68-70.

作者简介:王婷，女 ，湖南益阳人 ，2018级本科临床医学班在读

通讯作者:蒋银燕，讲师，主要研究生化分离分析

基金项目:长沙医学院创新性课题:长医教〔2019〕61号—179