不同浓度 AcD联合肿瘤坏死因子诱导人离体 HL7702肝细胞株凋亡及其作用机理

不同浓度 AcD联合肿瘤坏死因子诱导人离体 HL7702肝细胞株凋亡及其作用机理

陈琳 刘锐 章炜 通讯作者 : 刘锐

长沙医学院临床学院 湖南 长沙 410219

【摘要】目的 探讨不同浓度AcD联合肿瘤坏死因子诱导正常人HL7702肝细胞凋亡及PI3K/Akt信号通路对此过程的作用。方法 采用HL7702正常人肝细胞株，MTT法检测AcD对其存活力的影响；Hoechst33342形态学染色;流式细胞仪检测细胞凋亡情况；Westernblot方法检测细胞总Akt(丝氨酸苏氨酸蛋白激酶）及p-Akt蛋白表达。结果 AcD联合肿瘤坏死因子可诱导HL7702肝细胞凋亡，其浓度在20-50ng/ml范围内呈现剂量效应关系；PI3K/Akt特异性抑制剂wortmamiin能够增强AcD联合肿瘤坏死因子诱导的肝细胞凋亡。结论 AcD联合肿瘤坏死因子可诱导肝细胞凋亡，其机理可能是抑制PI3K/Akt信号通路。

【关键词】AcD；肿瘤坏死因子；细胞凋亡；肝细胞

肝细胞凋亡与多种肝脏疾病密切相关。放线菌素D(AcD)是一种转录抑制剂，主要作用是抑制DNA依赖性的RNA多聚酶活性，插入嘌呤嘧啶碱基对，阻断mRNA的生物合成，诱导例如ECV304NIH3T3等多种细胞凋亡^[1-2]。目前AcD已成为在细胞和分子水平上研究机体细胞凋亡的重要实验工具，但对其单独作用诱导肝细胞凋亡则未见报道，2015年9月—2016年9月，我们观察了AcD对肝细胞凋亡的诱导作用，并探讨其可能的分子机制。

1材料与方法

1.1细胞系和主要试剂正常人HL7702肝细胞株(中科院上海细胞所，用含10%新生牛血清RPMI1640，于37°C、5%CO2，饱和湿度条件下培养），AcD渥曼青霉素 wortmannin Hoechst33342(美国Sigma公司)，Akt抗体（Cell Signaling Technology公司)，ser473磷酸化Akt抗体(Santa Cruz公司)。

1.2方法

1.21 AcD对肝细胞存活力影响的检测 采用MTT法，将对数生长期的肝细胞以2<10⁴个/孔的密度接种于96孔细胞培养板，置37°C、5%CO2，饱和湿度条件下培养24h细胞贴壁后，吸出培养液;分别用AcD浓度为10 20 25 30 50 75ng/ml的培养液处理5h;每孔用RPMI 1640培养基冲洗3次，37°C 5%CO2继续培养24h，每孔加入20μ/L的MTT，温育4h，去培养基及MTT，每孔加入100μL DMSO，振荡数分钟，30min内在酶标仪（BioTek)上读取570nm处吸光度值（A_570mm)，以值表示细胞存活力。

1.2.2 细胞形态学观察取AcD处理组，wortmannin预处理2h，加入AcD处理组和正常培养组细胞，吸去培养基后，用预冷PBS洗3次，40g/L多聚甲醛在4下固定10mia弃固定液，PBS洗3次，自然晾干后用5mg/LHoechst33342室温闭光染色10min，PBS洗3次，室温晾干后于荧光显微镜下观察细胞形态并随机拍照。

1.2.3细胞凋亡率检测以每孔6*10⁵个肝细胞置于6孔板，37°C、24h,细胞贴壁后加入200nmol/L浓度的wortmannin预处理2h;加入终浓度为g/ml的AcD正常对照组加入等量培养液作用5h后，胰酶消化，收集细胞，制成单细胞悬液，用PBS洗3次，70%乙醇固定，4°C过夜，pbs洗3次，RNA酶37°C作用30min,加入PI染色剂,4。作用30min,FAC Sort型流式细胞仪测定。

1.2.4 Akt(丝氨酸苏氨酸蛋白激酶)和p-Akt蛋白表达检测肝细胞用冷PBS洗3次，加入200μl裂解液,置冰上30min后，用细胞刮取器刮下细胞，4。,14000r/min离心10min,上清即为总的细胞蛋白溶解成分。按常规方法进行SDS-PAGE电泳1h,分离胶为傷;80V转膜（经甲醇处理的PVDF膜）3h,%BSA封闭2h后，置于兔抗人一抗(用封闭液1:1000稀释)中,4C过夜,TBST洗3次，每次10min置辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（用封闭液1:1000稀释)中1.5h,TBST洗3次，每次10min用ECL系统检测Akt和p-Akt蛋白，X线片曝光，凝胶图像分析仪扫描图像。

1.3统计学方法采用SPSS21.0统计软件分析，检测数据用x±s表示，作单因素方差分析t检验。

2结果

2.1 AcD对肝细胞存活力的影响用AcD处理肝细胞5h,在一定浓度范围可导致细胞存活力显著降低。如表1所示，随着AcD的浓度的增高,其对细胞的抑制程度增加， AcD浓度20~50ng/ml范围内,对细胞存活力的抑制程度呈现出明显的量效关系。

表1 AcD对肝细胞存活力的影响(x±s)

注:与浓度为0时比较,*P<0.05,**P<0.01

2.2细胞形态学变化荧光显微镜下可见，正常细胞染色质在核内分布均匀；用AcDPg/ml处理细胞5h,细胞核高度皱缩、边聚，同时伴有染色质凝聚及核碎片出现用wortmannin预处理2h再加入AcD处理5h,与仅用AcD处理比较，出现核碎片的细胞明显增多。

2.3细胞凋亡率 AcD 诱导细胞5h组(组2)细胞调亡率为27.9%,而先用wortmannin200nmol/L预作用2h再用AcD诱导5h组(组3)细胞凋亡率达39.7%(P<0.05);仅wortmannin作用细胞2h组(组4)与阴性对照组(组1)比较，P>0.05说明仅存在wortmannin情况下,不造成肝细胞凋亡，但却能增强AcD诱导的肝细胞凋亡。

图1 Wortmannin 增强AcD诱导的肝细胞凋亡效应

注:组2和组3比较,ΔP<0.05;组2和组1比较,*P<0.05;组3和组1比较,*P<0.05

2.4 Akt蛋白表达阴性对照组p-Akt有一定表达，但加入AcD处理5h则表达明显减少,先加入PI3K/Akt抑制剂wortmannin预作用细胞2h再加入AcD处理5h基本未见p-Akt蛋白表达-不同方法处理后总Akt蛋白表达无明显差异。

3讨论

AcD是一种作用于DNA依赖性的RNA多聚酶的转录抑制剂，插入嘌呤嘧啶碱基对可阻断mRNA的生物合成，诱导多种细胞凋亡本研究发现,AcD具有稳定的诱导HL7702肝细胞凋亡作用^[3-4]；且其诱导凋亡作用在一定范围内呈剂量效应关系，故其可作为诱导肝细胞凋亡的稳定细胞模型。

近年来，PI3K/Akt作为细胞内信息物质引起了人们的关注，PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，是许多生命活动中关键的信号分子,参与调节细胞的分裂分化、凋亡等活动^[5]。有研究发现^[6-8]，AcD诱导ECV304细胞凋亡的机制可能是其作为一种转录抑制剂，阻断Akt的转录;或者是与PI3K/Akt通路上的某一蛋白结合，从而阻断Akt蛋白磷酸化及其活性。本研究通过Hoechst33342荧光染色以及流式细胞技术检测细胞的凋亡发现，AcD能够诱导肝细胞凋亡，为进一步了解这种诱导细胞凋亡的作用与PI3K/Akt信号通路的关系，我们在研究中选用了wortmannin,其为PI3K特异性的抑制剂，其可与PI3K的ATP结合区中某一赖氨酸残基共价结合，在纳摩尔浓度即能抑制PI3K及相关酶的活性。本研究发现wortmannin能增强AcD诱导的肝细胞凋亡在加入AcD诱导细胞凋亡后磷酸化Akt蛋白的表达较对照组明显降低，说明AcD诱导细胞凋亡的作用可能与PI3K/Akt信号通路有关^[9]。而wortmannin预处理再用AcD诱导，则基本上未见磷酸化Akt蛋白的表达-说明wortmannin增强AcD诱导细胞凋亡的作用可能与进一步PI3K/Akt信号通路有关，由此进一步证明了AcD诱导细胞凋亡的作用可能与抑制PI3K/Akt信号通路相关^[10-11]。

综上所述,AcD能稳定诱导HL7702肝细胞株凋亡；PI3K/Akt信号通路的抑制有可能只是其诱导细胞凋亡的机制之一，由AcD引发的其他信号通路的激活或者抑制有待于进一步研究证实。

参考文献

[1].Lau JY, Xie X,et al.Apoptosis and viral hepatitis. Semin Liver Dis.1998;18(2):169-175.

[2].Christopher Soll,et al. Serotonin Promotes Tumor Growth in Human Hepatocellular Cancer .Hepatology, 2010;51:000-000.

[3]马体栋,赵凡,李碧香.慢病毒介导Akt1 shRNA载体转染对人肝母细胞瘤细胞株HepG2凋亡和增殖的影响[J].肿瘤药学,2019,9(04):572-577.

[4].Shi J, Aisaki K, et al.Evidence of hepatocyte apoptosis in rat liver after the administration of carbon tetrachloride. Am J Pathol.1998;153（2）:512–515.

[5]肖懿慧,袁祖贻.普洱茶提取物对巨噬细胞株 RAW264.7凋亡的作用[J/OL].心脏杂志,2019(05):506-509[2019-12-01].

[6].Nocito A, Georgiev P, Dahm F,et al. Platelets and platelet-derived serotonin promote tissue repair after normothermic hepatic ischemia in mice. Hepatology, 2007,45:369-376.

[7]张斌斌,王湘琦,赵超然,熊爱兵.阻断PI3K/AKT/mTOR通路增强顺铂诱导的人皮肤黑素瘤细胞株A375凋亡的机制研究[J].中国美容医学,2019,28(08):72-76.

[8].Nanji AA et al. Apoptosis and alcoholic liver disease.Semin Liver Dis.1998;18(2):187-190.

[9].Saavedre JE,et al. Design of a liver-selective NO donor prodrug that blocks tumor necrosis factor-α-induced apoptosis and toxicity in the liver. J Med Chem,1997,40(13):1947-1954.

[10]范园园,黄艳,余新炳.华支睾吸虫Severin与HBV-X共同作用对肝细胞和肝癌细胞凋亡和周期影响的相关性研究[J].热带医学杂志,2019,19(06):669-673+809.

[11].Rabinovitch M et al.Linking a serotonin transporter polymorphism to vascular smooth muscle proliferation in patients with primary pulmonary hypertension. The Journal of Clinical

Investigation,2001,108:1109-1111.

基金项目：湖南省教育厅研究项目（15C0148）