黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范及其主要成分抗肿瘤活性研究

黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范及其主要成分抗肿瘤活性研究

张兆心

哈药集团世一堂中药饮片有限责任公司 150000

【摘 要】黄连、萸黄连饮片制备技术规范的有效论述，不但能够有效提升整体药品制备质量水平，从而为药品使用环境提供更加稳定的市场适用平台，同时更能够凭借抗肿瘤活性的有效鉴别，增强临床医疗工作开展的可靠性，为后续药品生产企业的经济发展提供基础的制备方法保障。本文根据黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范展开分析，在明确抗肿瘤活性与标准规范满足当前市场用药的要求同时，期望能够为后续药品生产企业的发展提供良好参照。

【关键词】黄连药材、萸黄连饮片；制备技术；主要成分；抗肿瘤活性

黄连、萸黄连标准饮片制备工艺研究

根据中药饮片内黄连药材在炮制后可直接用于制剂生产的特点，不但提升了医药产业在药品制备方面的效率，同时也确保了药品使用具备较为广泛的市场。但在药品质量方面，却仍旧尚未具备完善的评价体系，并且在药品制备过程中，根据器械和反应环境的状况可知相对复杂，故而单纯以药材评价饮片的质量明显缺乏合理性。由此基于饮片制备技术的流程，需要明确处理过程中存在的药品质量影响，这样才能够确保制备技术规范能够被有效制定。以下根据粉碎机存在的差异性展开分析，期望能够为规范的制定提供保障。

试验材料与仪器

仪器：可变速高速旋转粉碎机、高速多功能粉碎机、高效液相色谱仪、数显鼓风干燥箱、分析天平、电子天平、超声波清洗器、马福炉、高效薄层板。

材料：盐酸小檗碱与表小檗碱试品、黄连碱、巴马汀；乙腈、乙醇、四氢呋喃为色谱纯；盐酸、磷酸二氢钾、纯净水、十二烷基硫酸钠、环乙烷等均为分析纯。

试验方法分析

取黄连饮片分为实验组与对照组，每份选取30g，在可变速高速旋转粉碎机中以不同转速进行粉碎，并进行过筛处理，而后针对其中转速与粒度之间的关系进行记录。之后，精密称取黄连药材粉末于锥形瓶中，确定含量需求并加甲醇-盐酸（100:1）溶液定容至指定刻度。超声处理30min，稍冷后称定重量，再以甲醇补足损失重量且摇匀，使用微孔滤膜进行过滤，后再根据试品浓度需求加甲醇稀释，而后再进行相色谱仪分析。

技术分析论述

由实验可知，在不同转速粉丝过程中得到的黄连饮片粉末，其粒度存在非常显著的差异，其中转速越高，粉末中细分含量便越高。其次，在不同转速环境中，小檗碱、表小檗碱、黄连碱与巴马汀含量并无明显影响，如此说明样品成分均匀性较好，也确保了中药饮片的安全性与质量可控性，对后续临床医疗而言具备非常重要的意义。

黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范方向

基于以上试验可知，在加强整体黄连、萸黄连标准饮片制备技术过程中，必须明确药材来源与药材采集方法，这样才能够确保材料满足质量生产需求；其次，在制备方法开展过程中，应当依次对药品进行杂质去除、水洗、蒸润、堆润、切制、干燥、筛选等工作，这样才能够确保在粉碎工作完成后，确保药性不会受到较大的影响；最后，在药品制备过程中，需要随机挑选药品进行检查， 确保性状鉴别工作能够有效落实，同时还应当针对水分、漫出物、含量进行分析，确保色谱条件与系统适应性满足药品使用需求，并能够巩固测定法与指纹图谱条件展开的稳定性，这样才能够避免药品生产与实际需求产生偏差，并影响整体黄连、萸黄连标准饮片销售市场的质量水准。

黄连、萸黄连主要成分抗肿瘤活性研究

试验材料与仪器

小檗碱与吴茱萸碱试品、1640培养液、胰酶、胎牛血清、MTT、CCK-8、染色液、细胞凋亡检测试剂盒、DNA含量检测试剂盒、BCA试剂盒、荧光显影液、细胞裂解液、30%丙烯酰胺、氯化钠、异丙醇、甲醇。

试验方法分析

细胞培养

细胞株由专业药理实验室保存，复苏后培养 基为含有10%FBS的1640培养液,在温度37°C,5% CO₂的恒温培养箱中培养，每2d换液-次, 4~5d即可传代。

小檗碱与吴茱萸碱对肿瘤细胞抑制作用研究

取对数生长期的细胞调整细胞浓度为1.2x10⁵/mL,接种在96孔板,加入药物，使药物最终浓度为2.5、5、7.5、10、20、40、60、80、100 μmol/L ,每种浓度做3个复孔，同时设立空白组、调雾组,在细胞培养箱中培养24、48h后，每孔加入20μL MTT,继续在培养箱中培养4h后,酶标仪在490nm下检测各组的吸光度OD值。

AnnexinV-FITC/PI双染法检测HepG2凋亡分析

取处于对数生长期状况良好的HepG2细胞消化至单细胞悬液后使用细胞计数板计数。

将计数后的细胞悬液稀释，以106个/孔接种于6孔培养板中,每孔2mL ,置于37°C , 5% CO₂恒温培养箱培养。

培养24h左右，待单层细胞长至约70%时,去除旧培养基每孔加入2 mL新鲜配制的药液。药物的浓度分别为0、10、20、40、80 umol/L。 加药后，将6孔板置于37°C、5%CO2恒温培养箱培养48h。

去除旧培养基，每孔加入1mLPBS润洗两逼，除去PBS后，每孔加入500μL胰酶，待细胞消化完全后,加入培养架2 mL终止消化，用移液枪吹打细胞,将细胞转移到离心管, 1500rpm离心5 min。

离心后去除上层，残余的培养基弹匀细胞，加入冷的PBS2mL，轻轻吹打均匀，1500rpm离心5 min，移去上清液，再重复一次清洗细胞，充分除去胰酶与培养基。

加入500儿L Binding Buffer悬浮细胞，轻轻吹散均匀，再加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL染色剂,混匀。避光反应5~ 15 min。

1h内上流式细胞仪进行检测，激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm。

试验结果论述

根据肿瘤活性变化与分流式细胞仪分析检测结果可知，随着小檗碱浓度增加,总凋亡率呈现逐渐增加的趋势,当浓度为20umol/L时,细胞总凋亡率(早期凋亡与晚期凋亡)升高不明显,在其浓度达到40umol/L开始,其凋亡率与con组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，呈现出了浓度依赖性。

基于以上论述可知，小檗碱对细胞有生长抑制作用:药物作用24h时，小檗碱对A549、HepG2、MgC803三种细胞的抑制作用随浓度的增加而增强,当浓度为80umol/L时,抑制率为25%左右;药物作用48h时,抑制率大于30%，且对HepG2细胞的抑制作用明显。

为了进一步研究生小檗碱诱导细胞HepG2凋亡作用，采用AnnexinV-FITC/PI双染法，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并与坏死细胞区别。正常细胞中,磷脂酰丝氨酸分布在细胞膜脂质双分子层的内侧,细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸由内侧外翻。AnnexinV是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸具有高度亲和力，因此能够与早期凋亡细胞的胞膜结合。将AnnexinV进行荧光素FITC标记,以标记了AnnexinV作为荧光探针，可以被流式细胞仪检测。PI (碘化丙啶)是一种核酸染料，能够将细胞核染红，但是不能透过完整的细胞膜,晚期凋亡与坏死的细胞细胞膜完整性遭到破坏，可以被染色。所以运用Annexin V-FITC/PI双染法可以将正常细胞、早期凋亡、晚期凋亡与坏死细胞区别开。

结语

黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范的有效落实，不但能够凭借技术特性为整体药品制备环境提供相对系统的保障，同时更能够根据技术细节的制定，为后续药品生产企业经济体系的构建提供了完善的参照，并为当前药品质量平台的构建打下了扎实的基础。故而，在论述黄连、萸黄连标准饮片制备技术规范与其主要成分抗肿瘤活性研究过程中，必须针对制备流程和药性状况细致检查，这样才能够确保试验工作落实有效。

参考文献

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