羌归膝舒丸中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的含量测定

羌归膝舒丸中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的含量测定

杜志谦  1 , 2 ， 李卢 1 , 2 ，夏华玲 1 ， 张利静 2 ， 胡媛媛 2

1. 河南省 洛阳正骨医院 · 河南省骨科医院 ，河南 洛阳 471000 ； 2. 河南中医药大学 ，河南 郑州 450008

[摘要] 目的:建立羌归膝舒丸中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的含量测定方法，为该制剂的质量控制提供参考。 方法: 采用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-DVD），色谱柱为 WondaSil ® C₁₈柱（4.6mm*250mm，5um）；流动相：乙腈-水（60:40）；柱温：30℃；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：330nm；进样量：10uL。结果：蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的线性范围分别为0.310～2.480ug（r=0.9996）、0.112～0.896ug（r=0.9996），其平均加样回收率分别为97.5%、98.3%，RSD分别为1.35%、1.51%。结论:该含量测定方法测定的羌归膝舒丸中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯成分，精密度高、重复性好，可用于该制剂的质量控制。

[关键词] 羌归膝舒丸；蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯；含量测定；HPLC-DVD

Determination of Osthole and Columbianadin in Qiang Gui Xi Shu Pills

DU Zhi-qian^1,2,Li Lu^1,2,XIA Hua-ling¹, Zhang Li-jing², Hu Yuan-yuan²

(1.Luoyang Orthopedic Hospital of Henan Province Orthopedic Hospital of Henan Province ,Luoyang He`nan 471000,China；2. He Nan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou,He`nan,450008，China)

[Abstract] Objective:To establish a method for content determination of osthole and columbianadin in Qiang Gui Xi Shu Pills.Method:HPLC-DVD was used.the analysis was carried on WondaSil ® ODS(4.6mm*250mm,5um)column,the mobile phase was the acetonitrile-water(60:40);The column temperature was 30℃;The flow rate was 1.0mL·min^-1.the detection wave was 330nm.Result:The responses of osthole and columbianadin were linear in the ranges of 0.310～2.480ug（r=0.9996）、0.112～0.896ug（r=0.9996）,The average recoveries were 97.5%、98.3%,RSD分别为1.35%、1.51%.Conclusion:This method is accurate,reproducible and convenient for quality control over Qiang Gui Xi Shu Pills.

[Key words] Qiang Gui Xi Shu Pills;osthole and columbianadin;determination;HPLC-DVD

羌归膝舒丸是河南省洛阳正骨医院的医院制剂品种，由羌活、独活等14味中药组成的复方制剂。本品为浅褐色至黑褐色的浓缩丸，味苦，微辛。具有舒筋活络，疏肝健脾作用，用于关节病中期，关节屈伸受限，膝部疼痛，以内侧为甚，行走跛行等症状。该制剂质量标准研究方面已建立了独活、血竭、当归、赤芍薄层色谱定性鉴别研究，但无含量测定方法。为提高药品质量，保证用药安全，对君药独活进行含量测定。本文采用HPLC法对活性成分蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯进行含量测定，为该制剂的质量控制提供参考。

1仪器、试药

1.1仪器

SHZ—D( Ⅲ) 型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；HH—6 型数控恒温水浴锅(上海比朗仪器有限公司)；Agilent 1260型高效液相色谱仪 (G1315D型DAD检测器，Agilent化学工作站，美国 安捷伦公司)；KH—2200DB型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；Sarterius BS 224S 电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2试药

羌归膝舒丸（批号：20160105，20160306，20160403 河南省洛阳正骨医院 河南省骨科医院）；蛇床子素（批号为0822-200204 中国药品生物制品检定所）和二氢欧山芹醇当归酸酯（批号为111583-200402 中国药品生物制品检定所），乙腈为色谱纯(美国，Merck)；水为双蒸水并经0.45μm水系滤膜滤过；乙腈为色谱纯(天津市永大化学试剂有限公司）

2方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

WondaSil ® C₁₈ 色谱柱( 4.6 mm×250 mm，5um)，流动相：乙腈-水（60：40）；柱温：30℃；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：330nm；进样量：10uL。理论塔板数按羌归膝舒丸中二氢欧山芹醇当归酸酯峰计算应不低于6000。

2.2混合对照品溶液的制备

取蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为0.1550mg/mL、0.0560mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品适量，研细，取约3.0g，精密称定,置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理 40min(250W，50kHz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀,静置，取上清液过0.22um微孔滤膜滤过，即得。

2.4阴性对照液的制备

按处方量并以相同的工艺分别制备缺独活的阴性对照样品，照上述供试品溶液制备方法处理，得阴性对照溶液。

2.5方法学考察

2.5.1专属性实验

精密吸取混合对照品、供试品及阴性对照溶液各 10μL，注入液相色谱仪进行测定。结果阴性对照色谱中，在与对照品及供试品色谱图对应保留时间处无相应色谱峰，表明其它组份对羌归膝舒丸中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的测定无干扰，结果见下图1、图2、图3。

1

2

图1 混合对照品

1

2

图2 供试品

图3 缺独活阴性

图1对照品溶液； 图2供试品溶液；图3缺独活阴性溶液（1蛇床子素、2二氢欧山芹醇当归酸酯）

2.5.2线性关系考察

按2.1项下色谱条件，取2.2项下混合对照品溶液（蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯分别为0.1550mg/mL、0.0560mg/mL），分别用自动进样器进2，4，6，8，10，12，14，16μL，测定峰面积值，记录色谱图。以进样量（ug）为横坐标,相应的峰面积为纵坐标，得线性回归方程如下：蛇床子素：Y =5711.4X-120.2（R² = 0.9996）；二氢欧山芹醇当归酸酯：Y =4995.5X-53.593（R² = 0.9996）。进样量分别在0.310~2.480μg、0.112~0.896μg范围内线性关系良好。

2.5.3精密度试验

精密称取2.2项下对照品溶液10uL，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录羌归膝舒丸中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积，结果蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积的RSD分别为0.91%、0.91%。表明该方法的精密度良好。

2.5.4 稳定性试验

取同一种供试品溶液，在制备后分别于0、2、4、6、8、12小时，注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进行测定蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积值，RSD分别为0.47%、1.50%，表明蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯在12h内稳定性良好。

2.5.5重复性试验

取同一批次的羌归膝舒丸，按2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，计算蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的平均质量分数分别为0.544、0.062mg/mL，RSD分别为0.57%、1.93%。

2.5.6加样回收率试验

分别取已知含量的羌归膝舒丸约1.5g(蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯含量分别为0.544mg/g、0.062mg/g)，共 6 份，精密称定，分别加入适量的蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯对照品分别为5.39、1.72mL（蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯浓度分别为0.1520mg/mL、0.0540mg/mL），照上述供试品溶液的制备方法及色谱条件进行测定，结果显示蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的加样回收率的RSD分别为1.35%、1.51%，见下列表。

表1 加样回收率实验结果（n=6）

由表可知：本方法测得蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的加样回收率平均值为97.5%、98.3%，回收率的RSD均小于3%，故用该方法测试结果符合定量分析要求。

2.5.7样品的测定结果

取3批羌归膝舒丸样品，照上述供试品溶液制备方法制备，在上述的 HPLC 色谱条件下测定并记录色谱峰面积，经计算，得测定结果见下表。

表2 特制接骨丸样品含量测定结果

3 讨论

3.1提取溶剂、提取方法和提取时间的考察

在提取羌归膝舒丸中蛇床子素和二氢欧山芹当归酯酸成分的研究中，对溶剂的种类和用量进行了考察，发现选择乙醇超声提取30min，得到的峰形不好，基线不稳，且测得的含量偏低，故选择甲醇为提取溶剂。在考察溶剂用量中，10mL、30mL的甲醇蛇床子素和二氢欧山芹当归酯酸提取率均低于20mL甲醇提取率，所以选择20mL作为溶剂提取用量。

实验过程中分别考察了加热回流、超声、冷浸提取三种方法，发现回流提取和超声提取效率基本一致，且超声提取略高于回流提取，超声提取法简单易行，误差小，故选择超声提取法来提取制剂中的蛇床子素和二氢欧山芹当归酯酸。

在对提取时间考察的过程中发现，30min、50min均不能使蛇床子素和二氢欧山芹当归酯酸提取完全，所以选择提取时间40min。

3.2流动相的选择

在HPLC色谱条件的研究中，分别比较了乙腈-水（48:52）、乙腈-水(55:45)、乙腈-水(58:42)，乙腈-水(60:40)，乙腈-水(49:51)，发现乙腈-水(60:40)的保留时间虽然缩短，但是主峰与杂质峰分离度不符合要求，且峰有峰前沿，而选择乙腈-水(49:51)峰形得到很大改善，且主峰与杂质峰分离度符合要求，保留时间适中，故选择乙腈-水(49:51)作为流动相。

本研究建立了羌归膝舒丸中蛇床子素和二氢欧山芹当归酯酸的含量测定方法，方法稳定可行，专属性高，精密度高，重复性好，其他组分干扰小，回收率高，可用于该制剂的质量控制。

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[7]张磊. 桃仁膝康颗粒的质量标准研究[D].河南中医学院,2015.

[8]国家药典委员会.中国药典(I部)[M].北京:化学工业出版社.2015.

 作者简介：杜志谦，男，研究员，硕士研究生导师，研究方向：从事中药复方制剂质量控制研究；

通讯作者:李卢，女，在读硕士研究生，从事中药复方制剂质量标准研究；Tel：18538855586；Email：

zhongyaozg@163.com

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