子宫内膜腺癌组织中 CD68、 YKL-40表达及其相关性研究

子宫内膜腺癌组织中 CD68、 YKL-40表达及其相关性研究

龚小燕 1，胡小青 1

1江西省妇幼保健院肿瘤科，江西，南昌 330006

摘要： 目的 分析CD68、YKL-40在子宫内膜腺癌组织中的表达情况及临床意义。方法 采用免疫组织化学Elivision方法检测20例正常子宫内膜、20例子宫内膜不典型增生、56例子宫内膜腺癌组织中CD68与YKL-40蛋白的表达。结果 ⑴CD68在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生、子宫内膜腺癌组织中的阳性表达率分别为30%、55%、80.4%，子宫内膜腺癌组与其他两组比较差异有显著意义（P<0.05）；CD68的表达与肿瘤的组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移有关，而与患者年龄和临床分期无关。⑵YKL-40在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生、子宫内膜腺癌组织中的阳性表达率分别为25%、40%、76.8%，子宫内膜腺癌组与其他两组比较差异有显著意义（P<0.05）；YKL-40的表达与肿瘤的组织学分级有关，而与患者年龄、临床分期、肌层浸润深度和淋巴结转移无关。⑶CD68与YKL-40蛋白在子宫内膜腺癌组织中的表达呈正相关（r_s=0.367，P=0.005）。结论 CD68、YKL-40在子宫内膜腺癌组织中过表达，并呈正相关，两者可能共同参与了子宫内膜腺癌的发生发展，且在EAC中TAM发挥促瘤作用的机制之一可能是通过高表达YKL-40蛋白。

关键词：子宫内膜腺癌；CD68；TAM；免疫组织化学；YKL-40

Expression of CD68 and YKL-40 in endometrial adenocarcinoma and their correlation

GONG Xiao-yan¹,HU Xiao-qing¹

The Oncology Department of Maternal and Child Health Care Hospital of Jiangxi Province，Nanchang，330006，China）

Abstract：Objective To analyse the expression and clinical significance of CD68 and YKL-40 in endometrial adenocarcinoma.Methods Using Immunohistochemical Elivision method to detect the expressions of CD68 and YKL-40 protein in 20 cases of normal endometrium,20 cases of atypical hyperplasia of endometrium and 56 cases of endometrial adenocarcinoma.Results ⑴The positive expression rates of CD68 in the normal endometrium,atypical hyperplasia of endometrium,and endometrial adenocarcinoma group were 30%, 55% and 80.4% respectively, and the last group compared with the other two groups have significant difference (P<0.05); The expression of CD68 was significantly correlated with histological grade,, myometrial invasion, lymphnode metastasis,but not with ages,and clinical stages of endometrial adenocarcinoma.⑵The positive expression rates of YKL-40 in the normal endometrium, atypical hyperplasia of endometrium,and endometrial adenocarcinoma group were 25%,40% and 76.8% respectively, and the last group compared with the other two groups have significant difference (P<0.05); The expression of YKL-40 was significantly correlated with histological grade,but not with ages,clinical stages, myometrial invasion,lymphnode metastasisof endometrial adenocarcinoma.⑶There was a positive correlation between CD68 and YKL-40 expressions in endometrial carcinom（

r_s=0.367,P=0.005）.Conclusion The expression of CD68 and YKL-40 are closely related to the carcinogenesis and development of the endometrial carcinomal tumorigenesis,and TAM may play a role of promoting tumor by secreting YKL-40 protein in endometrial adenocarcinoma.

Key words: endometrial adenocarcinoma; CD68; TAM; immunohistochemistry; YKL-40

大多数学者认为肿瘤的间质其实是个慢性炎症的过程，其中数量最多的炎症细胞群是巨噬细胞^[1]。肿瘤间质中的巨噬细胞我们称之为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAM)，CD68高表达于巨噬细胞，可以用来标记TAM。YKL-40作为巨噬细胞分泌的高度保守的糖蛋白，在肿瘤细胞的增殖、血管生成、组织重建和抗凋亡过程中发挥重要作用。本研究通过免疫组织化学方法分别检测正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生、子宫内膜腺癌组织中CD68及YKL-40的表达，探讨两者在子宫内膜腺癌中发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1实验对象

收集2011年1月～2012年12月我院经病理确诊为子宫内膜腺癌手术石蜡包埋标本56例，患者年龄38～71岁，平均53岁，所有患者术前均未进行激素、放疗和化疗治疗，所有病例均除外骨关节病、心脏病、肝病、内分泌疾病和其他肿瘤病史。另收集子宫内膜不典型增生20例、正常子宫内膜（子宫肌瘤行子宫全切患者）20例作为对照组。所有标本均经我院病理科专家医师复审病理诊断。

1.2试剂及实验方法

主要试剂：即用型鼠抗人CD68（标记TAM）单克隆抗体，购自福州迈新生物技术开发有限公司；YKL-40鼠抗人单克隆抗体浓缩液（1：200），购自香港Abcam公司。采用免疫组化Elivision法检测CD68和YKL-40在三组组织中的表达，用购买试剂公司所提供的已知CD68和YKL-40阳性切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3判断标准

YKL-40与CD68蛋白阳性细胞表达均为：细胞浆着色，表现为棕褐色/棕黄色颗粒状。每张经免疫组化染色之后的切片，均在病变区随机选择高倍视野（×400），每个视野计数100个细胞，至少10个随机视野，取其平均值。以着色细胞占视野细胞的百分率分4个等级：阳性细胞≤10%为1分、＞10%~50%为2分、＞50%~75%为3分、＞75%为4分。按阳性细胞染色强度评分：无着色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。以阳性细胞数评分与染色强度评分相加得出最后得分：以0～7表示。( - ) ：1分为阴性、2~3分为阳性（+）、4~5分为较强阳性（++）、6~7分为强阳性（+++）。（+）、（++）与（+++）为阳性组进行统计学分析。

1.4统计学方法

运用SPSS17.0统计软件对所有研究数据进行统计学分析和处理。CD68、YKL-40在三组组织中的阳性率等计数资料采用四格表资料卡方或Fisher确切概率法检验，以P <0.05为差异有统计学意义。CD68、YKL-40蛋白表达相关性采用Spearman相关分析法，r值界于-1与1之间，r值为正表示正相关，r值为负表示负相关，r等于零为零相关。

2 结果

2.1 YKL-40与CD68在三组组织中的表达

YKL-40与CD68均表达于胞浆（附图）。YKL-40在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生、子宫内膜腺癌组织中的阳性表达率分别为：25%（5/20）、40%（8/20）、76.8%（43/56）。子宫内膜腺癌组中YKL-40的表达与另外两组比较差异有显著意义（P<0.05）。CD68在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生、子宫内膜腺癌组中的阳性表达率分别为：30%（6/20）、55%（11/20）、80.4%（45/56）。子宫内膜腺癌组中CD68的表达与另外两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

图1 YKL-40在正常子宫内膜中 图2 YKL-40在子宫内膜不典型增生中 图3 YKL-40在子宫内膜腺癌中

阴性表达（10×10） 阳性表达（10×10） 阳性表达（10×10）

Figure1 The negative expression of YKL-40 Figure2 The positive expression of YKL-40 Figure3 The positive expression of YKL-40

in normal endometrium (10×10) in atypical hyperplasia of endometrium (10×10) in endometrial carcinoma (10×10)

图1 CD68在正常子宫内膜中 图2 CD68在子宫内膜不典型增生中 图3 CD68在子宫内膜癌中

阴性表达（10×10） 阳性表达（10×10） 阳性表达（10×10）

Figure1 The negative expression of CD68 Figure2 The positive expression of CD68 Figure3 The positive expression of CD68

in normal endometrium (10×10) in atypical hyperplasia of endometrium (10×10) in endometrial carcinoma (10×10)

2.2 YKL-40、CD68的表达与子宫内膜癌临床病理参数关系

YKL-40的表达与肿瘤组织学分级有关（P<0.05），而与患者年龄、临床分期、肌层浸润深度和淋巴结转移情况无关。CD68的表达与肿瘤组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移有关（P<0.05），而与患者年龄和临床分期无关。具体见表1。

表1 YKL-40、CD68蛋白表达与子宫内膜癌临床病理参数关系

Table 1 The relationship between the expression of YKL-40 and CD68 protein and clinicopathological parameters in endometrial carcinoma

2.3 YKL-40与CD68在三组组织的相关性

在56例子宫内膜腺癌组织中，YKL-40与CD68同时阳性表达率为67.9%（38/56），同时呈阴性表达者为6例；有7例为YKL-40表达阴性而CD68表达阳性；有5例为YKL-40表达阳性而CD68表达阴性。用Spearman相关分析显示：CD68与YKL-40蛋白在子宫内膜腺癌组织中的表达呈正相关（r_s=0.367，P=0.005）。

3 讨论

既往多认为，巨噬细胞是抗肿瘤免疫调节过程中的一种重要细胞群，可直接杀伤肿瘤细胞，或者通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答从而清除肿瘤。而Porta^[2]等研究指出，巨噬细胞具有杀伤肿瘤和促瘤生长的双重作用。巨噬细胞在不同环境中通常活化为2种类型^[3]：(1) M1型巨噬细胞，即经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophage)，其功能是参与Th1型免疫应答，它们能杀伤微生物和肿瘤细胞，分泌大量炎性因子，从而抗感染和抗肿瘤；(2) M2巨噬细胞，即替代性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophage) ，其功能是参与Th2型免疫应答，抑制Thl型免疫应答和诱导局部的免疫耐受，促进血管生成，参与组织重塑和修复。肿瘤间质中的巨噬细胞称之为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。TAM的活化表型特征目前尚未得以明确，不过现今大量的研究均间接支持TAM为M2型巨噬细胞^[4]。TAM作为侵入实体肿瘤中单核细胞群的主要组成细胞，大量存在于肿瘤血管周围、无血管区和低氧区，是炎症进展成为癌症的主要桥梁^[5]。研究^[6]显示TAM在人类多种肿瘤中均有超表达，其与恶性肿瘤的血管生成、浸润转移发生及转归有密切关系，可作为一个恶性肿瘤预后的独立评价指标。有学者^[7]表明在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中YKL-40主要来源可能是TAM，且推测YKL-40可能成为反应体内TAM状况的指标。

YKL-40又称为人类软骨糖蛋白39(human cartilage glycoprotein-39，HCgp-39)，最早是在非泌乳期牛的乳汁分泌物中被发现的^[8]。人类YKL-40的基因位于1号染色体q31-q32上，含有10个外显子，基因组DNA长度约10.9kb^[9]。YKL-40蛋白是由383个氨基酸构成的多肽链，属于糖基水解酶18家族的成员，其氨基末端三个氨基酸分别为酪氨酸 tyrosine (Y)、赖氨酸 lysine (K) 、和亮氨酸 leucine (L)，分子量为 40KD，因此命名为YKL-40^[10]。最早人们研究YKL-40时，多与类风湿性关节炎、骨关节炎等炎症性关节疾病相联系，近年来多数学者发现其与恶性肿瘤关系甚密。研究表明YKL-40可过表达于多种人体实体肿瘤中，如肺癌、乳腺癌、大肠癌、卵巢癌、前列腺癌、恶性胶质细胞瘤、子宫恶性肿瘤和胰腺癌等^[9]。YKL-40的具体生理功能和作用机制尚不十分清楚。有学者对正常人体不同组织进行免疫组化检测，结果发现在细胞活性高的组织，其表达也相对较高^[11]。现有研究^[12]发现YKL-40可能是通过参与细胞增殖和分化、新生血管形成，促进组织纤维化等基质重塑和抗凋亡来发挥作用；YKL-40可调节细胞外蛋白激酶的磷酸化过程从而控制有丝分裂，刺激小血管分枝形成、迁徙以及血管平滑肌细胞的黏附来调制血管内皮细胞的状态，限制细胞外基质的变性来控制组织重塑，还可启动磷脂酰肌醇3激酶信号通路以及蛋白激酶B的磷酸化过程^[13]。另有学者认为YKL-40在肿瘤组织中活化后，通过自身活性，降解基底膜成分，同时调节肌动蛋白细胞骨架，促进细胞迁移，最终导致肿瘤的侵袭和转移。初步研究^[14]表明血清YKL-40可作为子宫内膜癌的诊断及预后的重要参考指标。Shao等^[15]在大鼠体内种植了乳腺癌细胞株MDA-MB-231及结肠癌细胞株HCT-116后，YKL-40异位表达组较对照组肿瘤体积大，拥有广泛的血管生成表现，使用小干扰RNA基因阻断YKL-40的基因表达能够抑制肿瘤血管生成。因此可发现YKL-40在肿瘤细胞的增殖、分化和肿瘤微环境构建过程中发挥重要作用。

该实验应用免疫组化方法分别检测YKL-40与CD68蛋白在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生和子宫内膜腺癌组织中的表达情况。我们通过实验发现该两种蛋白在子宫内膜腺癌组织中的表达率明显高于另外两组。在正常子宫内膜组织和子宫内膜不典型增生组织中YKL-40与CD68的表达无相关性，但在子宫内膜腺癌组织中YKL-40与CD68的表达呈正相关（r_s=0.367，P=0.005）。因此笔者认为YKL-40与TAM具有相关性，且在子宫内膜腺癌组织中YKL-40的来源可能主要是TAM。相关的基础研究也显示，在正常的单核细胞中YKL-40并不表达，只有在巨噬细胞活化后才高表达

^[16]。YKL-40可能是执行TAM生物学作用的下游蛋白之一。依据本实验结果YKL-40与CD68在子宫内膜腺癌组织中高表达，这说明YKL-40和TAM可能共同参与了EAC的发生发展，且在EAC中TAM发挥促瘤作用的机制之一可能是通过高表达YKL-40蛋白。然而癌症的发生发展机制极其复杂，且是多种因素长期共同作用的结果，在EAC中YKL-40和TAM的具体作用机制还有待于进一步研究。

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第一作者简介：龚小燕（1988-3），女，南昌大学医学院研究生，硕士，主要研究方向：妇科肿瘤。联系方式：18270976977。E-mail:547098825@qq.com。通讯地址：江西省赣州市章贡区红旗大道94号（国际时代广场小区16栋1单元702室）。

通讯作者简介：胡小青（1969-01），女，江西省妇幼保健院肿瘤科，硕士，主任医师，硕士生导师。通讯地址：江西省南昌市八一大道381号。