二烯丙基二硫对辐照小鼠血睾屏障的保护效应

二烯丙基二硫对辐照小鼠血睾屏障的保护效应

许帅 ,廖伟雄 #

肇庆医学高等专科学校 526020

摘要：二烯丙基二硫( Diallyl disulfide，简称DADS)，是一种小分子量的大蒜脂溶性提取物，也是大蒜素的活性成分之一，有清除自由基、提高细胞抗氧化能力之功效。DADS 对多种疾病有预防和治疗作用，在放疗方面可能具有辐射保护和辐射增敏等双重效应。而且，大蒜是一种天然植物，毒性小、廉价及使用便利，有利于广泛应用。本文通过实验初步探讨了DADS对辐照小鼠血睾屏障的保护作用，研究DADS对辐照小鼠血睾屏障的保护作用及其机制。

关键词：二烯丙基二硫；辐照损伤；小鼠；保护效应

　电磁脉冲(E lectromagne tic pulse, EMP)是一种高能、超宽频谱电磁波, 在民用和军事领域均有广泛的运用, 其生物学效应已受到各国学者广泛的关注。睾丸是EMP高度敏感器官之一。既往研究大多侧重于研究DADS对辐照损伤小鼠睾丸生精上皮和间质细胞保护效应，对对血-睾屏障保护效应的研究较少。本研究采用常规苏木精-伊红染色(HE )、硝酸镧示踪电镜, 观察辐照损伤小鼠经二烯丙基二硫预处理后其血-睾屏障结构改变情况，分析其在小鼠血-睾屏障中的保护效应, 为电磁脉冲辐射对生殖器官的损伤与防治提供理论基础。

1材料和方法

1.1试验动物与分组

8周龄B alb /c雄性小鼠30 只, 体重(25 ±1)g, 广东省实验动物中心提供（许可证号：SCXK(粤)2013-0002）。随机分为观察组与对照组各15只。观察组小鼠腹腔注射DADS，剂量为20 mg/kg，连续注射3天。对照组不予以DADS腹腔注射。在观察组小鼠完成注射后，第二天进行照射，各组小鼠分别在辐射后2, 6,12, 24和48 h随机各取3只进行观察。

1.2照射条件

将两组小鼠分别装入有机玻璃盒内, 垂直置于辐射场中, 接受场强为400 kV /m 全身照射, 前沿3 ns, 脉宽340 ns, 脉冲间隔25 s, 共计200个电磁脉冲。

1.3实验方法及步骤

1.3.1HE染色与电镜观察

　　观察组与对照组小鼠分别于辐射后上述五个时间点各取3只, 在戊巴比妥钠腹腔注射(40mg /Kg)麻醉下, 取双侧睾丸, 左侧睾丸固定于Bouin’ s液24h, 常规脱水石蜡包埋, 连续切片(4^μm), 裱贴于三-氨丙基三乙氧硅烷(3-M ino propy ltriethoxy silane,APES)处理过的载波片上, 行常规HE 染色;右侧睾丸迅速固定于镧醛固定液, 随即切为1mm² 大小继续固定2 h, 用含镧的0.1mo l /L二甲砷酸钠缓冲液浸洗3次, 每次10m in, 然后用不含镧的10 g /L四氧化锇(O _sO₄ )固定2h, 经二甲砷酸钠缓冲液浸洗后常规电镜梯度丙酮脱水, Epon-812 包埋, LKB-N oVa 型超薄切片机切片, 用JEM-2000EX 型电镜观察。

2结果

2. 1HE染色观察

HE 染色结果显示, 在400 kV /m电磁脉冲辐照条件下，经二烯丙基二硫处理的观察组小鼠生精小管内生精上皮排列规则, 无明显生精上皮的脱落、坏死现象出现。而在同样辐照条件下的对照组, 辐射后2 h即可见生精小管管腔内生精细胞变性、少数凋亡、坏死及脱落, 以精母细胞居多, 基底室内出现细胞缺损, 伴精原细胞核浓缩,支持细胞胞核明显缩向基底面, 并与生精细胞相分离;辐射后6 h, 12 h和24 h, 以上现象有加重的趋势;辐射后48 h, 部分生精小管内出现基底室与近腔室的分离, 生精小管基膜不同程度增厚, 局部缺损, 间质水肿, 毛细血管轻度扩张, 内皮细胞核浓缩变性, 基底膜轻度增厚, 显示血-睾屏障结构明显损伤。

2. 2电镜观察

在400 kV /m电磁脉冲辐照条件下，经二烯丙基二硫处理的观察组的小鼠，各级生精细胞、支持细胞和紧密连接结构清晰, 镧颗粒在生精小管沉淀于基膜和基底室内精原细胞与细线前期精母细胞间。而未经过二烯丙基二硫处理的小鼠，在400 kV /m电磁脉冲辐照条件下， 各级生精细胞不同程度胞核浓缩变性, 少数细胞呈现凋亡图象(核染色质浓缩边集, 沿核膜呈圆环形或半月形), 或坏死, 尤以精原细胞和精子细胞为明显, 同时, 支持细胞紧密连接部分结构裂解破坏, 或模糊不清, 并见镧颗粒更广泛沉淀于各级生精细胞间, 其中辐射后2 h即可见到镧颗粒突破支持细胞紧密连接, 在近腔室内精母细胞、圆形精子细胞、精子间均可见沉淀;辐射后6h, 12 h, 24 h和48 h, 在生精小管内还可见逐渐增多的凋亡与坏死的生精细胞, 以细线前期精母细胞与晚期粗线期精母细胞居多。

3讨论

国内外研究显示, 电磁脉冲辐射可对中枢神经系统、内分泌系统、心血管系统、免疫系统和视觉系统等多系统、多脏器造成损伤。对生殖系统的研究发现, 小鼠接受电磁脉冲辐射后, 睾丸的各级生精上皮均遭到不同程度的损伤, 其中精原细胞、精子细胞和精子是最敏感靶细胞;电镜结果显示小鼠睾丸间质细胞亦遭到严重破坏,属于电磁脉冲辐射高度敏感细胞之一。然迄今尚罕见有关对血-睾屏障的保护效应的研究。

文章主要研究在电磁脉冲辐射对小鼠睾丸血-睾屏障的保护效应, 并对相关机制进行初步探讨。众所周知, 血-睾屏障是睾丸的重要结构, 为精子的发生提供了稳定的微环境, 一旦其结构基础受到损伤, 势必影响其功能, 从而进一步影响到精子的发生。血-睾屏障的结构主要包括毛细血管内皮及其基膜、结缔组织、生精上皮基膜和支持细胞紧密连结。紧密连结是构成血-睾屏障的主要结构。这种支持细胞紧密连结复合结构将生精小管的的生精上皮分为基底室和近腔室两部分, 为研究血-睾屏障结构提供了便利。通过HE染色和硝酸镧示踪电镜, 我们发现, 400 kV /m 电磁脉冲辐射后2 ～48 h内逐渐增多的大量生精细胞脱落入管腔, 以细线前期精母细胞与晚期粗线期精母细胞居多;支持细胞胞核明显缩向基底面, 突起明显减少, 紧密连结结构发生破坏, 部分生精小管内出现基底室与近腔室的分离, 同时, 血-睾屏障的其他结构(毛细胞血管内皮及其基膜、结缔组织、生精上皮基膜)也发生损伤;特别是辐射后2 h即可见镧颗粒突破支持细胞紧密连接, 在近腔室内精母细胞、圆形精子细胞、精子间都可见沉淀。以上结果均提示, 电磁脉冲辐射后48 h内, 不仅生精细胞受到损伤, 支持细胞也受到损害, 进而影响血-睾屏障的结构, 使其通透性明显升高。但经过二烯丙基二硫处理的小鼠却未出现上述情况，有文献报道, 在体内和体外试验均证实, 可能二烯丙基二硫对蛋白的水平具有一定的调节作用, 从而调节血-睾屏障精密连接结构，起到保护效应。同时体内的研究还证实, 二烯丙基二硫可以调节生精上皮间的固定连接，起到保护效应。通过以上两条途径, 二烯丙基二硫可能控制着血-睾屏障的开启与闭合, 控制精子发生中生精细胞向管腔的运动。通过本次实验结果显示,二烯丙基二硫对辐照小鼠血睾屏障有一定的保护效应，其可能的作用机制是电磁脉冲辐射后在小鼠睾丸内二烯丙基二硫，有 调节血-睾屏障结构的动态平衡的作用, 最大限度地维护精子的正常发生。

综上所述, 高强度的电磁脉冲辐射可迅速、直接导致睾丸支持细胞及其紧密连接形态结构的变化,引起血-睾屏障结构和功能的损伤, 经二烯丙基二硫处理，可能有效的调节血-睾屏障结构的动态平衡，在此过程中发挥重要的保护效应。

参考文献:

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基金项目：肇庆市科技创新指导类项目（2016040301-5），肇庆医学高等专科学校中青年科技基金项目（Zqyq16-0010），肇庆医学高等专科学校2015年度校级科研项目（2015K66）

作者简介：许帅（1981—），男，硕士，讲师，研究方向为放射医学.

通信联系人：廖伟雄，副教授。E-mail: y2866011@163.com