流式细胞术检测Th1/Th2在再生障碍性贫血中发病机制的研究

流式细胞术检测Th1/Th2在再生障碍性贫血中发病机制的研究

王明良王亚鹏孙斌斌

抚顺矿务局总医院辽宁抚顺113000

摘要：目的通过流式细胞术检测再生障碍性贫血患者中Th1/Th2细胞的数量，进一步探讨其在再障发病机制中的作用。方法用流式细胞术检测43例再生障碍性贫血患者和40例正常对照者抗凝血CD4＋Ｔ淋巴细胞IFN—γ、IL—4的分泌，分别反映Th1、Th2细胞的数量。结果再生障碍性贫血患者Th1样细胞因子IFN—γ的水平较正常对照组明显增高（P<0.05），Th2样因子IL—4与正常对照组无明显差异（P>0.05）。结论再生障碍性贫血患者Th1水平明显增高，Th2水平基本正常，提示可能是因为Th1/Th2比例失衡导致再障造血衰竭。

关键词：流式细胞术；Th1/Th2；再生障碍性贫血

【中图分类号】R789.1【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0062-01

再生障碍性贫血简称再障，是一组由多种病因所致的骨髓功能障碍，以全血细胞减少为主要表现的综合征。确切病因尚未明确，已知再障发病与化学药物、放射线、病毒感染及遗传因素有关[1]。目前大量研究[2]表明免疫调节机制的紊乱在再障的发病中起着关键作用。我们应用IFN—γ、IL—4分别是Th1、Th2的代表性细胞因子，通过流式细胞术对再障患者外周血中的Th1、Th2的表达进行检测，并分析其在发病机制中的作用。

1病例与方法

1.1病例选取2014年4月到2015年4月一年间均符合全国再障诊断标准的43例再障患者，男性21例，女性22例，年龄14—70岁，中位年龄29岁。对照组40例，为正常志愿献血者，其中男性22例，女性8例，年龄18—50岁，中位年龄33岁。

1.2仪器与试剂流式细胞仪购自美国Beckman—Coulter公司。主要试剂为FITC标记的鼠抗人CD4单克隆抗体，PE标记的鼠抗人IFN—γ和IL—4单克隆抗体，FITC标记的鼠抗人同型阴性对照IgG1和PE标记的鼠抗人同型阴性对照IgG1，破膜剂以及固定剂均购自美国Sigmo公司。

1.3方法无菌抽取诊断后治疗前的再障患者和对照组外周血4ml，用EDTA抗凝后，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml，取100μl单细胞悬浮液分别加入两支试管作为测定管（A管）和阴性对照管（B管），放入5%CO2培养箱培养4h，其后取出100μl，加入适量CD4—FITC，室温避光孵育15min，500转/分离心5min，弃上清，用固定剂室温固定15min后加入破膜剂，5min后两管分别加入IFN—γ—PE、IL—4—PE适量，室温避光孵育15min，PBS洗后加入1.0mlPBS，通过流式细胞仪收集20000个细胞进行分析。

1.4统计学分析所有数据均通过SPSS19.0版软件进行t检验统计学处理分析，实验数据TFN—γ和IL—4用平均值±标准差表示。

2结果

2.1再障患者CD4＋Ｔ淋巴细胞IFN—γ、IL—4的表达通过流式细胞术检测再障患者外周血细胞胞浆中的IFN—γ表达率明显高于对照组（P<0.05），而IL—4得表达率两组无显著性差异（P>0.05）。（见表1）

3讨论

目前再生障碍性贫血的发病机制还不明确，研究表明[3]，可能与药物、化学毒物、电离辐射、病毒感染、免疫因素、遗传因素以及阵发性睡眠性血红蛋白尿等因素有关。再生障碍性贫血主要表现[4]是造血功能衰竭，大部分再障患者经过免疫抑制剂治疗后可缓解症状，说明免疫功能异常[5]在再障的发生和发展中有重要地位。机体CD4+T淋巴细胞可分化为Th1、Th2两种亚型的细胞[6]，前者介导细胞免疫，后者介导体液免疫。正常情况下两种亚型及其分泌的细胞因子共同调节机体的免疫应答过程[7]，处于动态平衡，维持机体正常的细胞免疫和体液免疫功能[8]。Th1和Th2之间存在着相互促进或制约的作用，与其他的细胞因子组成一个复杂的分子网络，参与机体的免疫反应和自身稳定。细胞因子网络的稳定[9]在机体中维持造血功能正常起着重要作用，其平衡失调与再生障碍性贫血的发病机制中免疫因素密切相关。在很多疾病状态下这种平衡被打破，发展为Th1型或Th2型优势的免疫应答。再障患者体内的Th1细胞过度激活[10]，导致Th1和Th2细胞的比值显著升高，而Th1细胞激活程度与机体造血功能呈负相关，表明Th1和Th2细胞的确是再障发病中的重要效应细胞。再生障碍性贫血属于Th1细胞亢进的疾病[11]，临床上应用免疫抑制剂治疗也可以证明T淋巴细胞及其分泌的因子在再障中的重要作用。至于其具体机制，还有待进一步研究。

对于再生障碍性贫血的发病机制，目前存在三种学说[12]，分别为造血干细胞缺陷，免疫紊乱以及骨髓微环境异常，而免疫紊乱[13]为目前的研究热点，也就是细胞因子网络处于非稳定状态。从治疗角度来看，人为的将Th1/Th2细胞的数量恢复正常会成为治疗再障的新策略。

参考文献：

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