miR-200c对大鼠肝星状细胞间质-上皮逆转分化的调控作用

miR-200c对大鼠肝星状细胞间质-上皮逆转分化的调控作用

邵军宋晓静陈川宁刘友平李洪段春燕

邵军宋晓静陈川宁刘友平李洪段春燕

[摘要]目的：探讨miR-200c对大鼠肝星状细胞间质-上皮逆转分化的调控作用，以寻找调控大鼠肝星状细胞MET的作用靶点。方法：培养大鼠肝星状细胞株并乙醛激活，将激活细胞随机分为miR-200cmimics组、miR-200cNC组和空白对照组。对miR-200c处理后细胞采用ELISA法、RT-PCR及Western-blot等技术分析大鼠肝星状细胞间质-上皮逆转分化的调控作用。结果：ELISA结果显示，miR-200cmimics组比较NC组和空白对照组Col-Ⅰ及FN的含量明显下调。Western-blot显示，NC组和空白对照组比较，miR-200cmimics组E-cadherin蛋白表达量增高，而vimentin、P-Smad3、ZEB1和ZEB2的蛋白表达量降低，其P<0.05，差异具有统计学意义。RT-PCR结果显示，转染后miR-200cmimics组ZEB1mRNA的相对表达量低于NC组和空白对照组，且差异具有统计学意义（p<0.05），而ZEB2和Smad3mRNA的相对表达量，各组差异具无统计学意义（p>0.05）。结论：ZEB作为肝星状细胞的发生EMT过程中的作用靶点，miR-200c通过直接抑制ZEB基因转录或者翻译而发挥对肝星状细胞间质-上皮逆转分化的调控作用。

[关键词]miR-200cZEB上皮－间质转化间质-上皮转化肝纤维化

DOI:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2015.28.46

本文系四川省科技厅应用基础研究计划（14JC0038），四川省教育厅科研项目（12ZB242）。

作者单位：646000，四川泸州，泸州医学院生物化学与分子生物学教研室

TheRegulationFunctionofMiR-200cforMesenchymal-epithelialTransitiononHepaticStellateCellsofRats

ShaoJun,SongXiaojing,ChenChuanping,LiHong,DuanChunyan

Abstract:ObjectiveTostudytheregulationfunctionofmiR-200cformesenchymal-epithelialtransitiononhepaticstellatecellsofratsandlookforregulatingtherathepaticstellatecellsMETcontroltargets.MethodsThehepaticstellatecelllineswerecultivatedandactivatedbyacetaldehyde,andrandomlypidedintomiR-200cmimics,miR-200cNCandblankcontrolgroup.TheregulationfunctionofELISA,RT-PCRandWestern-blotonthemiR-200chepaticstellatecells’METofratswasanalyzedafter.ResultsELISAresultshowsthatcomparedwiththeblankcontrolgroupandmiR-200cNCgroup,theconcentrationofCol-IandFNweredecreasedobviouslyinmiR-200cmimicsgroup(P<0.05).Western-blotresultshowsthattherelativeexpressionofE-cadherininmiR-200cmimicsgroupwashigherthantheothertwogroups,whiletherelativeexpressionamountofvimentin,Smad3,ZEB1andZEB2proteinwaslowerthantheothertwogroups.TheZEB1mRNArelativeexpressionlevelinmiR-200cgroupmimicsgroupwasrelativelylow.AndthereisnosignificantdifferenceofmRNASmad3andZEB2levelinthreegroups(P>0.05).Conclusion:Asthetargetpointofhepaticstellatecells’EMT,ZEBcanbedirectlycontrolledandreversedbyMicroRNA-200cmimics,whichcanconsequentlyregulatetheMETofhepaticstellatecells.

Keywords:miR-200c;ZEB;EMT;MET;liverfibrosis

上皮－间质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）是指细胞逐渐丧失了上皮细胞的特征而获得了间质细胞的特征。肝星状细胞在静息状态下保持着上皮细胞的特征，肝星状细胞被激活后向肌成纤维细胞转化，这一过程被认为是EMT现象[1]。

目前研究发现，微小RNA（MicroRNA，miRNA）是EMT重要的调节者[2]。另有研究表明，EMT是肝纤维化过程中的早期阶段，并且是可以逆转的。目前对肝星状细胞发生EMT的调控机制的研究尚不十分明确，主要强调终止EMT的过程，而忽略了其逆转分化即间质-上皮转化（mesenchymal-epithelialtransition，MET）的过程。近年来miRNA在EMT调控及其逆转分化作用越来越受到国内外学者的关注。本实验采用肝星状细胞培养、脂质体转染、ELISA法、RT-PCR及Western-blot等检测技术寻找调控大鼠肝星状细胞MET调控的作用靶点。

1材料与方法

1.1材料大鼠肝星状细胞株（HSC-T6），购于湖南大学细胞中心。LipofectamineTM2000购自美国invitrogen公司；rno-miR-200cmimics及rno-miR-200cNegativecontrol由上海吉玛制药技术有限公司合成；大鼠Ⅰ型胶原蛋白酶联免疫分析试剂盒及大鼠纤维粘连蛋白酶联免疫分析试剂盒购自美国ADL公司；总RNA提取试剂盒（TIANGEN，北京）；RT-PCRKit>ReverTraAce组合型（BioBRK，成都）；E-cadherin（R868）、vimentin(I444)、Smad3（P417）、ZEB2抗体购自美国Bioworld公司；ZEB1（H-102）抗体购自SantaCruz公司；Ⅱ抗购自美国Jacksonimmuno公司等。

1.2方法

1.2.1HSC-T6培养和激活[3]用10%胎牛血清DMEM培养基培养HSC-T6，置于CO2培养箱中（37℃、5%CO2），视情况更换培养基。当细胞密度达到80%，生长情况良好时，将细胞以1～2×105的密度接种于六孔板中。随机将细胞分组为乙醛刺激组和空白组，乙醛刺激组加入刺激剂乙醛（终浓度200μmol/L），刺激时间为24h，每12h追加一次，对照组用等量培养基补齐。

1.2.2细胞转染乙醛刺激后细胞随机分组为：miR-200cmimics组、miR-200cNC组和空白对照组。将miR-200cmimics转染复合物和miR-200cNC转染复合物分别加入相对应的组内，空白对照组仅加入同等浓度的脂质体lipofectamin2000，最终是各孔体积用双无培养基补齐至2ml。继续培养6h后，更换完全培养基，转染时间共24h后进行后续试验。

1.2.3ELISA法检测大鼠Ⅰ型胶原蛋白和大鼠纤维粘连蛋白收集上述各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明及操作分别检测Ⅰ型胶原蛋白和纤维粘结蛋白。实验重复3次，取3次实验数据的平均值。实验结果以均数±标准差（表示。

1.2.4细胞总RNA抽提及逆转录按总RNA提取试剂盒说明书操作提取细胞内总RNA。取1000ng总RNA作为模板反转录产生第一链cDNA，反转录使用根据ReverTraAce逆转录试剂说明书进行。

1.2.5半定量PCR采用ReverTraAce试剂盒，以各组的cDNA为模板，分别扩增Smad3、ZEB1、ZEB2，PCR扩增条件是95℃预变性2min，95℃30s、58℃30s、72℃1min，30个循环。

1.2.6PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳预先配置2%琼脂糖凝胶，加样，电泳30min。电泳结束后将凝胶浸泡在EB染液中3min，取出后放入凝胶成像系统进行照相。

1.2.7Western-blot技术检测相关蛋白表达提取各组细胞蛋白质，定量，SDS-PAGE分离，利用半干式电转移将凝胶中的蛋白质转移至NC膜上。将转移后的NC膜取出，5%脱脂牛奶封闭2h后，用相应Ⅰ抗孵育，4℃，过夜，1×TBST洗膜5min×3，孵育Ⅱ抗2h。取显影液均匀的滴加到NC膜上，放入凝胶成像系统中成像。

1.2.8统计分析将图像用QuantityOne进行灰度值分析，比较各组所检测蛋白相对表达量的变化。实验结果采用SPSS17.0进行统计学分析，P<0.05差异有统计学意义。

2结果

2.1乙醛激活HSC-T6发生EMT

2.1.1ELISA法检测大鼠Col-Ⅰ和FN含量

应用ELISA试剂盒检测乙醛诱导HSC-T6过程中，细胞分泌物Col-Ⅰ和FN含量的变化，乙醛刺激组Col-Ⅰ和FN含量高于空白对照组(表1)，p<0.005。表明，乙醛刺激后HSC-T6分泌的Col-Ⅰ和FN增加，细胞出现了纤维化改变。

2.1.2Westernblot技术检测细胞E-cadherin蛋白和vimentin蛋白的表达量

采用Westernblot技术检测乙醛刺激组及空白对照组细胞蛋白中E-cadherin和vimentin蛋白的表达量。图1显示，乙醛刺激组E-cadherin蛋白的表达量较空白对照组明显降低，而乙醛刺激组vimentin蛋白的表达量较空白对照组有明显的增高，P<0.05，差异均具有统计学意义。结果证实了乙醛刺激HSC-T6后细胞发生了EMT改变。

2.2MicroRNA-200c对MET的调控作用

2.2.1ELISA法检测转染后大鼠细胞Col-Ⅰ和FN含量乙醛刺激HSC-T6发生EMT，采用脂质体转染剂lipofectamin2000进行瞬时转染miR-200cmimics。miR-200c发挥对EMT的作用，miR-200cmimics组比较NC组和空白对照组Col-Ⅰ及FN的含量明显下调(见表2和图2)

2.2.2Western-blot技术检测转染后E-cadherin、vimentin、Smad3（P417）、ZEB1和ZEB2的蛋白表达量细胞内转染miR-200cmimics，Western-blot检测miR-200cmimics组、NC组和空白对照组的E-cadherin、vimentin、P-Smad3、ZEB1和ZEB2的蛋白表达量的变化（图3），利用Quatityone软件对目的蛋白的灰度值比较，与NC组和空白对照组比较，miR-200cmimics组E-cadherin蛋白表达量增高，而vimentin、P-Smad3、ZEB1和ZEB2的蛋白表达量降低，其P<0.05，差异具有统计学意义。

*与NC组及空白对照组比较，P<0.05。

2.2.3转染后RT-PCR技术检测Smad3、ZEB1和ZEB2在mRNA水平的表达量

HSC-T6经乙醛刺激发生了EMT转化，采用脂质体转染剂lipofectamin2000进行瞬时转染。经2%琼脂糖凝胶电泳后，miR-200cmimics组、NC组和空白对照组的ZEB1、ZEB2和Smad3基因经RT-PCR后的电泳图谱（图4）。图中显示，转染后miR-200cmimics组ZEB1mRNA的相对表达量低于NC组和空白对照组，且差异具有统计学意义（p<0.05），而ZEB2和Smad3mRNA的相对表达量，各组差异具无统计学意义（p>0.05）。

3讨论

肝纤维化的发生发展是一个极其复杂的病理过程，它是由多种致病因素引起的肝脏创伤修复反应从而导致细胞外基质合成增多和降解减少的动态失衡和肝功能严重受损，它是各种慢性肝病发展到肝硬化和肝癌的必经的病理过程。ZEB蛋白(zincfingerE-boxbindinghomeobox,ZEB)即E盒结合锌指蛋白，是重要的细胞核转录因子，其家族成员包括ZEB1和ZEB2。ZEB蛋白在EMT发生过程、组织纤维化和肿瘤等均有表达。有研究表明，TGF-β和下游信号激活的磷酸化Smad2/3能够上调一些转录因子特别是ZEB蛋白表达，并且ZEB蛋白作为E钙粘蛋白的主要抑制因子，使它成为EMT过程最重要的促进因子[4]。另有研究发现[5]自分泌TGF-β/ZEB信号网络系统调控细胞在上皮细胞状态和间质细胞状态之间的转化具有可塑性。

miR-200家族与ZEB之间存在一个双向负性反馈环，两者之间的相互抑制作用主要依赖于它们相对的表达量多少。miR-200家族通过ZEB/miR-200双向负性反馈环直接导致EMT与MET之间的转化。在NMuMG细胞中发现，miR-200家族通过直接定位ZEB1和ZEB2而正向调节E-cadherin的表达，实现对EMT的抑制作用[6]。miR-200家族参与EMT的调控，在TGF-β诱导EMT的细胞中，miR-200家族五个成员的表达水平严重降低。在小鼠乳腺癌细胞中miR-200家族成员可直接定位并结合到ZEB基因mRNA的3’UTR区下调ZEB的表达，最终增强E-cadherin的表达和抑制癌细胞的迁移[7]。

为探讨miR-200c及其靶基因在大鼠肝纤维化MET中的作用，本实验采用乙醛刺激肝星状细胞发生EMT后，将外源性的miR-200c模拟物转染入细胞，以增强内源性miR-200c的表达，后者作用于ZEB1/2mRNA的3’UTR区，以调控ZEB1/2的表达。ELISA法结果显示，miR-200cmimics组、空白对照组及miR-200cNC组比较，miR-200cmimics组Ⅰ型胶原蛋白和纤维粘连素含量明显降低，表明加入外源性miR-200c模拟物后可作用于其靶基因ZEB使大鼠肝星状细胞出现间质-上皮逆转分化。

实验进一步采用WesternBlot及RT-PCR技术检测经外源性的miR-200c模拟物转染后细胞中E-cadherin蛋白、vimentin蛋白、Smad3、ZEB1和ZEB2的表达量。实验结果表明，miR-200cmimics组中E-cadherin蛋白表达量较其他两组高，而vimentin和P-Smad3、ZEB1和ZEB2表达量较其他两组相应蛋白表达量相对较低。上述结果说明miR-200c作用其靶基因后对大鼠肝纤维化的逆转分化的作用。通过RT-PCR技术检测各组Smad3、ZEB1和ZEB2在mRNA水平的表达量，与空白对照组和NC组比较，miR-200cmimics组的ZEB1mRNA和ZEB2mRNA表达量相对降低，而Smad3mRNA表达量降低不明显。实验结果表明ZEB作为miR-200c的靶基因受到了miR-200c的沉默作用，而miR-200c对Smad3的直接沉默作用不明显，miR-200c可能通过ZEB负反馈抑制Smad3蛋白、vimentin蛋白的表达，出现了肝星状细胞的EMT向MET的转化。

综上所述，ZEB作为肝星状细胞的发生EMT过程中的作用靶点，miR-200c通过直接抑制ZEB基因转录或者翻译而发挥对肝星状细胞间质-上皮逆转分化(MET)的调控作用。但对于miR-200c在肝星状细胞中的表达变化以及对肝纤维化的进程能产生的影响和作用，仍需进一步进行实验研究。相信miR-200c很有可能成为肝纤维化的重要的治疗靶标，为逆转或延缓肝纤维化的发生寻找到新的途径。

参考文献:

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[2]SayanAE，GriffithsTR，PalR，etal．SIP1proteinprotectscellsfromDNAdamage-inducedapoptosisandhasindependentprog-nosticvalueinbladdercancer[J]．ProcNatlAcadSciUSA，2009,106(35):14884-14889.

[3]段春燕,陈川宁,严冬梅等.乙醛刺激大鼠肝星状细胞活化的动力学分析[J].泸州医学院学报,2012,35(3):254-257.

[4]OritLeshem,ShalomMadar.TMPRSS2/ERGPromotesEpithelialtoMesenchymalTransitionthroughtheZEB1/ZEB2AxisinaprostateCancerModel[J].PLOSONE,2011,6（7）:1-11.

[5]PhilipA.GregoryaB,CameronP.AnautocrineTGF-β/ZEB/miR-200signalingnetworkregulatesestablishmentandmaintenanceofepithelial-mesenchymaltransition[J].MBoC,2011;22:1686-1698.

[6]BrabletzS,BrabletzT.TheZEB/miR-200feedbackloop-amotorofCellularplasticityindevelopmentandcancer[J].EMBO,2010;11:670-677.

[7]ParkSM,GaurAB,LengyelE.ThemiR-200familydeterminestheepithelialphenotypeofcancercellsbytargetingtheE-cadherinrepressorsZEB1andZEB2[J].Genes,2008;22:894-907.