右归饮促异体骨髓细胞向成骨分化防治辐照后骨量丢失机制的实验研究

右归饮促异体骨髓细胞向成骨分化防治辐照后骨量丢失机制的实验研究

张葆鑫王兴国郝廷

内蒙古医科大学第二附属医院创伤一科呼和浩特010000

摘要：目的：研究右归饮对小鼠异体骨髓细胞向成骨分化的影响，探究其防治因辐照引起的骨量丢失的机制。方法：选取100只BALB/cCd小鼠，随机40只作为骨髓细胞提取回输，剩余60只小鼠分为空白对照组、辐照组、骨髓细胞回输组、（右归饮）低剂量组、总剂量组及高剂量组。分别对6组小鼠进行不同的处理，统计其骨密度、碱性磷酸酶浓度的差异以及组织损坏情况。结果：随着灌胃治疗右归饮浓度的增高，小鼠的骨密度及碱性磷酸酶浓度增高，组织损坏程度降低，骨小梁数量增多，高剂量组结果接近于空包对照组。结论：右归饮能够促进小鼠异体骨髓细胞的向成骨分化，对经辐照造成的骨量丢失情况有治疗作用。

关键词：右归饮；骨髓细胞；成骨分化；骨量丢失；辐射

骨量丢失是一种长期遭受电离辐射，骨骼成分含量下降导致的一种疾病，骨量丢失严重的患者可能出现骨质疏松甚至是骨折现象。大多数骨量丢失患者出现此病变的原因是进行了骨肿瘤放疗，这给病患造成了极大的身体和心理的伤害。骨髓干细胞具有高度的自我更新及分化发育能力，现阶段，我国在右归饮对骨髓细胞分化方面的研究还不足，本实验为完善此方面不足，选用γ辐射对骨髓细胞进行破坏，并观察右归饮对异体骨髓细胞向成分化的影响。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物

选取100只雄性BALB/cCd小鼠，平均体重（24±2）g，以40只作为骨髓细胞提取回输，剩余60只小鼠放入实验组。准备50g右归饮细粉，热水化开后放入冷藏备用。

1.1.2骨髓细胞提取

①将小鼠断颈处死，放入浓度为75%的酒精中3-5分钟后取出放置消毒盘中；②2.5mlPBS溶液冲洗骨髓腔细胞，离心去上清留1ml；③裂解红细胞，离心10min，去上清，放入冷藏备用。

1.1.3实验仪器

实验采用小动物成像仪以及γ辐射装置。

1.1.4右归饮制作

称重61g右归饮，在其中加入适量蒸馏水冲泡1h，每隔1.5h提取一次，共计2次后加入10倍蒸馏水，经4层纱布过滤后冷藏12h，以4000r/min的转速离心15min【1】，合并上清液后加热至沸腾，再进行冷藏12h，重复上述步骤，直至浓缩密度为1.35后进行减压干燥，并得到细粉，将细粉用热水化开后放入冷藏备用。

1.2实验方法

1.2.1电离辐射造模

骨髓提取时，实验组小鼠分6组，每组10只，第一组为空白对照组，剩余5组进行1Gy/min，时长6min的电离辐射。

1.2.2干预

六组干预措施如下：空白对照组不干预；辐照组只进行电离辐射；BM回输组进行电离辐射并以1：1比例回输骨髓细胞；高剂量组、中剂量组及低剂量组处进行电离辐射及回输骨髓细胞外，每天都对小鼠进行一次浓度分别为0.03ml/g、0.02ml/g、0.01ml/g的右归饮灌胃，时长两天。

1.2.3碱性磷酸酶检测

摘除眼球取血，冷藏4h后以3000r/min速度进行15min离心取上层血清并检测。

1.2.4骨密度检测

断颈处死小鼠，选用小动物成像仪拍摄，扫描小鼠股骨，利用骨密度检测软件分别检测6组小鼠的骨密度。

1.2.5组织结构观察

进行骨密度检测后，取小鼠双侧股骨的上端，分离组织，进行切片及HE染色，并观察组织损坏情况。

表1六组小鼠骨密度及碱性磷酸酶浓度比较

2结果

2.1骨密度及碱性磷酸酶浓度比较

将六组小鼠的骨密度与碱性磷酸酶浓度进行比较，可以看出，空白对照组、高剂量组、中剂量组的骨密度以及碱性磷酸酶浓度明显高于辐照组以及BM回输组；随着剂量的增加，骨密度及碱性磷酸酶浓度也增高。

2.2观察结果

辐照组在进行电离辐射后骨髓组织结构被打乱，且部分组织被损伤，骨小梁变稀疏，存在很大一部分的脂肪空泡；BM回输组的骨小梁明显多于辐照组，骨髓细胞数明显多于辐照组，但仍有部分组织遭到损伤；低剂量组骨小梁较辐照组增多，且骨髓细胞数多于经电离辐射的辐照组；高剂量组骨小梁增粗增多，骨髓细胞数远远大于辐照组，受损伤组织较少，几乎正常；中剂量组观测情况介于低剂量组与高剂量组之间。空白对照组的骨小梁坚实粗壮、骨髓细胞数正常。

3讨论

本实验中小鼠经γ辐射后，骨髓细胞减少，组织结构被打乱，骨小梁变疏松，骨密度下降，骨细胞的繁殖能力及成骨功能遭到损伤。通过检测骨密度发现y照射的组骨密度远低于空白对照组，实验表明电离辐射对小鼠骨量丢失有着直接的影响。

骨髓造血干细胞能够进行自我更新，此外，还具有高度的多向分化繁殖能力，它的组成成分较为复杂。主要包括间质干细胞、造血干细胞以及内皮祖细胞等。其中骨髓间充质干细胞能够在不同环境以及某些因子的影响下，分化成骨细胞，最终形成骨。早在上世纪90年代，国外学者就利用动物实验检测到了骨髓间充质干细胞在动物体内的走向，证明了其能够向不同造血以外的组织迁移定位，并且能够分化成为该组织的细胞【2】。此外，许多实验和研究表明，骨髓间充质干细胞的分化能力对治疗患者骨量丢失、骨骼成分下降、骨折难愈合、骨质疏松等有着不可忽视的作用。

碱性磷酸酶活性被生物学上认定为成骨细胞的重要标志之一，可作为一个判断成骨细胞活性的指标，监测其增殖及活动情况【4】。

右归饮是温补肾阳的良药【5】。从中医角度，肾主骨生髓。近年来国内外对右归饮对骨髓细胞的影响的研究主要以下述几方面为主：1）右归饮对激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓骨活性的影响。2）右归饮对体外成骨细胞的增殖及分化影响。3）骨髓间充质干细胞生物学特性的研究。4）人骨髓间充值干细胞培养、多向分化及鉴定。

多项细胞研究表明，右归饮能修复受损组织，促进骨骼间充质干细胞多向分化，并可能会延缓骨细胞的衰亡。

本实验表明，电离辐射能破坏并骨髓细胞，造成小鼠骨量丢失、骨密度下降，经过BM回输治疗后，骨密度及碱性磷酸酶浓度有所提高。对小鼠进行右归饮治疗后，可看出随着右归饮浓度的增加，小鼠骨密度及碱性磷酸酶浓度增加，骨小梁排列紧实而有序。

参考文献：

[1]叶丙霖，李盛华，李小宏，中药对间充质干细胞增殖与分化影响的研究进展[J].甘肃中医，2008，21（1）：14-15.

[2]吴云刚，肖鲁伟，童培建.右归饮对激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓骨火星影响的实验研究[J].中国骨伤，2009，2（22）：2.

[3]刘柯，鲁红伟，刘敬霞.骨髓干细胞动员及其治疗脑缺血损伤的临床研究进展[J].中国急救医学，2012，32（4）：364-368.

作者简介：张葆鑫，男，1985.03，内蒙古人，内蒙古医科大学第二附属医院创伤一科，硕士学历，主治医师，研究方向：创伤。

国家自然科学基金委员会资助项目，项目名称：右归饮对绝经后骨质疏松症骨髓间充质干细胞影响的分子机制实验研究，项目批准号：81460734

通讯作者：王兴国