Titin基因对精子和早期胚胎中HBV感染的影响

Titin基因对精子和早期胚胎中HBV感染的影响

侯志伟1黄继华2许小琴3罗慧旗1范舒舒1

1.粤北人民医院生殖中心广东省韶关市武江区惠民南路133号512025；2.中山市博爱医院广东省中山市东城区城桂路6号528400；3.成都锦江妇幼保健院四川省成都市锦绣路66号610066

摘要：目的Titin基因在胚胎发育中对HBV表达的影响。方法共转染HBV质粒和titin-siRNA干扰序列到人精子中，通过人-金黄地鼠异种受精技术和实时定量PCR技术，分析Titin基因敲除前后，HBVS基因和X基因在精子和早期胚胎发育中的表达。结果通过titin-siRNA干扰序列可显著改变HBVS基因和X基因在精子和2-cell中的表达。结论人titin基因的表达可对HBV在精子和早期胚胎的表达复制产生影响。

关键词：HBV；hsRNA；titin胚胎；早期发育

乙型肝炎（hepatitisB），是由乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）引发的，可能导致以肝脏炎性病变为主并可导致多器官损害的传染。HBV感染已经成为全球最严重和普遍的健康问题之一[1]。在中国HBV感染主要通过垂直传递进行传播，部分可能通过父婴垂直传递[2]。一些研究证明，HBV可通过整合进父源的精子上传递到子代中[3，4]。Kong等发现，HBV感染可通过影响胚胎发育从而改变妊娠结局[5]。研究人员经过抑制性消减杂交和基因芯片技术发现HBV和titin之间可能存在相互作用，本研究进一步验证了titin对精子和早期胚胎中HBV感染的影响。

1材料与方法

1.1实验材料

实验用pBR322-HBV质粒由第二军医大学细胞生物学教研室胡以平教授惠赠。293细胞系为实验室保存。人精子取自健康可育男性志愿者；实验用鼠为金黄地鼠。

1.2实验方法

使用上游法获得人精子，分别将HBV质粒和HBV质粒-Titin–siRNA转染进人精子，通过人精子和金黄地鼠卵受精获得2-cell。提取人精子和2-cell的mRNA，定量PCR验证HBV基因的表达。定量PCR数据使用2-ΔΔCt法进行分析。

1.3引物和siRNA干扰序列设计

实验用内参基因GAPDH、目标基因titin和HBVS基因和X基因的定量PCR引物由上海生工合成（表1）。TitinsiRNA干扰序列经上海吉玛公司设计和合成，siRNA干扰序列（表2）；转染试剂为Fugen，购自美国Qiagen；定量PCR用试剂购自美国Qiagen。

3.讨论

HBV能够以自由病毒粒子存在于精子细胞质内或整合到精子基因组内。由于HBV特殊的生命周期，其复制、转录和表达都依赖病毒mRNA和其表达相关的蛋白，因此mRNA是其具有感染活性的重要条件。研究发现，HBV感染会造成早期胚胎发育异常[5]。RNA干扰技术可以针对性的抑制目标基因mRNA的翻译和表达，而调节基因的生物学活性。Titin基因是本研究团队通过抑制性消减杂交和基因芯片技术获得的可能影响HBV表达的基因之一，其能够编码一种心脏发育和肌肉相关的骨架蛋白。通过将titin基因干扰序列和HBV转染进精子观察titin-siRNA可以影响HBV在精子和2-cell的表达，从而影响胚胎的发育。Kong等对IVF精子HBV阳性人群的妊娠结局进行分析，发现HBV阳性精子容易造成胚胎发育异常或流产等。由于titin基因在HBV感染人群中的作用机制尚不清晰，需要后续进行深入研究探讨其功能。

参考文献：

[1]WorldHealthOrganization（WHO）.HepatitisB.FactSheetWHO/204（2008）RevisedOctober2008.

[2]WHOGuidelinesApprovedbytheGuidelinesReviewCommittee（2015）Guidelinesfortheprevention，careandtreatmentofpersonswithchronichepatitisBinfection.

[3]HuangJM，HuangTH，QiuHY，etal.StudiesontheintegrationofhepatitisBvirusDNAsequenceinhumanspermchromosomes.AsianJAndrol，2002，4：209-212.

[4]HuXL，ZhouXP，QianYL，etal.ThepresenceandexpressionofthehepatitisBvirusinhumanoocytesandembryos[J].HumReprod，2011，26（7）：1860-1867.

[5]KongY，LiuY，LiuX，etal.RelationshipbetweenthemechanismofhepatitisBvirusfather–infanttransmissionandpregnancyoutcome[J].ArchGynecolObstet，2017，295（1）：253-257.

[6]ZhongY，LiuDL，AhmedMMM，etal.Hostgenesregulatetranscriptionofsperm-introducedhepatitisBvirusgenesinembryo[J].ReprodToxicol，2017，73：158-166.

注：基金项目：本研究获得国家自然科学基金（项目编号：30972526）、四川省应用基础研究项目（项目编号2014JY0110）和韶关市卫生计生科研项目（项目编号：Y18026）资助。