动态比浊法定量测定生脉注射液中的细菌内毒素

动态比浊法定量测定生脉注射液中的细菌内毒素

王美云

（长治市食品药品检验所山西长治046000）

【摘要】目的：采用动态比浊法(Kinetic-TurdimetricAseay,KTA)定量测定生脉注射液中的细菌内毒素。方法：采用KTA法检测5批生脉注射液的细菌内毒素。结果：生脉注射液稀释16倍可不干扰检测。结论：KTA可用于检测生脉注射液的内毒素。

【关键词】动态比浊法；生脉注射液；细菌内毒素

【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）26-0371-02

动态比浊法(Kinetic-TurdimetricAssay,KTA)的原理在于根据测定反应液浊度变化值所需要时间对数值与细菌内毒素浓度对数值的反比关系定量待测物的细菌内毒素的方法。因此KTA较传统家兔法，不仅具有定量测出药品的内毒素的优点，还克服了因动物耐受等原因而得到假阳性或阴性结果的缺点，因此该法已在欧美已成为注射液热原检查方法的主流趋势[1-3]。生脉注射液是临床常用于心血管疾病治疗的中药注射剂，为红参、麦冬和五味子制备的灭菌水溶液。目前对生脉注射液，乃至绝大部分的中药注射剂的内毒素检测仍靠家兔法进行。本课题尝试采用KTA检测生脉注射液的内毒素水平，不旨在为药厂生产和临床用药提供参考，希望为更多中药注射剂品种检测内毒素提供更多经验。

1.材料与方法

1.1材料

细菌内毒素标准品(规格：9000EU/Amp，批号：981)，内毒素用水(规格：10mL/支，批号：W99-2)，均由中国药品生物制品检定所提供；动态浊度法鲎试剂(规格1.2mL/支，湛江安度斯生物有限公司提供)；生脉注射液（国药准字：Z14020812，规格：10mL/支，批号：150301、150302、150402、151001和151202，江苏苏中药业集团股份有限公司提供）。

1.2仪器

EDS-99型细菌内毒素测定仪，ZH-2型自动涡旋混合器。

1.3生脉注射液细菌内毒素水平的检测方法

1.3.1检测的条件检测温度、波长和时间分别为37℃、660nm和<2h。本课题涉及的所有器皿经铬酸洗液处理后，250℃1h烘干。

1.3.2细菌内毒素限量细菌内毒素限量计算公式L=K/M（L：内毒素限量，K：默认值为5.0EU/mL，即静脉注射的细菌内毒素阈剂量，M：生脉注射液的单次最大给药剂量，M=6mL/kg）。

1.3.3细菌内毒素标准曲线的制备取1支细菌内毒素标准品，加内毒素用水1.0mL，采用漩涡混合器混合约10min，静置1min，再稀释至内毒素标准曲线对应浓度为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312与0.0156EU/mL，从每个浓度溶液中再各取0.15mL置于预先加入0.15mL的鲎试剂反应管，再次采用漩涡混合器混合均匀，以毒素用水为阴性，采用浊度仪检测，每个浓度的溶液重复检测3次，获得细菌内毒素标准曲线及方程。

1.3.4供试品的最大有效稀释倍数(MVD)：MVD=LC/λ，Ｌ：生脉注射液内毒素限值，λ：标准曲线的最低浓度(0.0156EU/mL），C：生脉注射液浓度。

1.3.5干扰预试验将150301批生脉注射液用毒素用水分别稀释4、8、16与32倍，标记为X。再取4个反应管，加入0.0625EU/mL的细菌内毒素标准溶液同倍稀释，标记为Y，分别取上述X和Y8个反应管各0.15mL，置于预先加入0.15mL鲎试剂的反应管，采用“1.2.3.细菌内毒素标准曲线的制备”项下的方法检测，计算内毒素回收率[内毒素回收率=(Y内毒素-X内毒素)/X100%]。

1.3.6供试品干扰试验取5批生脉注射液用毒素用水稀释16倍，平行操作，每个浓度重复3个反应管，采用“1.2.3.细菌内毒素标准曲线的制备”项下的方法检测。

1.3.7家兔热原验证取健康雄性家兔若干，体重约2.5kg，单笼饲养。依据现行《中国药典》2015版第一部附录ⅢA项下操作，每只家兔分别耳缘静脉注射10mL/kg，测量体温1次/2h，连续3次。取末次体温与均值体温的差值，即为兔体温的升高度数。不符合热原结论依据：第一次试验，3只兔升温≥0.6℃的例数>1只，或第二次试验5只升温≥0.6℃的例数>1只，或第一、二次试验合并8兔升温总数≥3.5℃。

2.结果

2.1细菌内毒素限量(L)与最大有效稀释倍数(MVD)

生脉注射液的L生脉注射液=0.83EU/mL，MVD为32倍。

2.2内毒素标准曲线的制备

标准曲线Log(T)=643.93-1637.6Log(C)，r=0.998，除了阴性对照，其余内毒素的反应时间在436～1251s，可参见表1。

3.讨论

中药注射剂临床应用时常发生过敏或类过敏反应，这些不良反应可能与内毒素水平相关。因此对于中药注射液尤其注重内毒素监控，为安全应用提供基本保障。本课题显示生脉注射液稀释16倍及以上可得到很好的KTA回收率，并且获得了家兔热原检测验证。

【参考文献】

[1]张娟，祝清芬，范治云.动态浊度法测定人参多糖注射液中细菌内毒素的含量[J].药学研究，2014，33(06):334-336.

[2]吴婷，曹霞飞，李薇.动态浊度法检测关节腔内注射用交联透明质酸钠中细菌内毒素[J].中国药房，2014，15(33):3144-3146.