四种淡水藻类的含量测定和抗氧化活性分析

四种淡水藻类的含量测定和抗氧化活性分析

朱月儿，李贝贝，周卓达，柴倩倩，鲁一帆，童素丽，徐润生*

浙江农林大学暨阳学院生物环境系，浙江诸暨311800

摘要：目的：藻类是集饲料、观赏为一体具有综合利用价值的水生植物，据文献报道狐尾藻具有良好的药用价值，且藻类分布广泛，产量大等特点，本项目对狐尾藻、黑藻、金鱼藻、苦草化学成分与药物活性进行研究。方法：应用不用分离原理的色谱分离填料如硅胶等与多种分离技术，并结合现代波谱分析(NMR，IR)和化学鉴别方法等手段分离四种藻的化学成分并进行结构鉴定。结果：藻类含有大量的黄酮类化学物，因此具有良好的抗氧化生物活性和总还原能力。结论：藻是一种来源广泛，在五水共治中起到重大作用，且具有良好的药用价值的水生植物，本项目为藻类治理水质和药用价值开发提供了研究基础。

关键词：藻类；抗氧化性；化学成分含量；结构鉴定

沉水植物是浅水湖泊的主要生物类群，占据了湖泊水体和底质间的界面，对湖泊生态系统的物质、能量循环和传递起着重要的调控作用。近年来，沉水植物[1.2]在控制湖泊富营养化和抑制藻类生长方面的作用备受关注，沉水植物的生长状况影响其对水体的净化功能和对湖泊富营养化的控制作用。随着农田水土流失的加剧，土壤进入湖库成为水生植物的重要基质，但目前，关于土壤进入水体后对沉水植物的生长及生理指标影响的研究相对较少。狐尾藻是一种常见的多年生沉水植物。狐尾藻为小二仙草科(Halorgaidaecae)狐尾藻属别名布拉狐尾、粉绿狐尾藻、青凤凰草、水聚藻等，原产于南美洲,具有很强的水体净化能力，被称为“水净化精灵”。狐尾藻（Myriophyllumspicatum）广泛分布于我国的浅水湖泊及河流，是长江中下游浅水湖泊中重要的沉水植物之一，因具有适应性较强、生物量积累较快等特点，它在富营养化湖泊的生态修复中的应用较广。

1、材料、仪器及试剂

狐尾藻、黑藻、金鱼藻、苦草2017年7月采集于浙江省诸暨市，由浙江农林大学王静敏鉴定，标本保存在浙江农林大学中药学专业研究室。

KQ-500B型超声波清洗器；UV-2000紫外可见分光光度计；ZF-C型三用紫外分析仪；Nicolet傅立叶变换红外光谱仪(IMPAC-400型)；INOVA-500核磁共振谱仪(TMS为内标)；AutospecUltima-Tof质谱仪；Waters600高效液相色谱仪(Waters2487检测器；Alltech公司EcnosphereC18制备柱22mm×250mm，10μm)，凝胶SephadexLH-20(Pharmacia公司生产)；柱色谱硅胶(200-300目)和薄层色谱硅胶GF254(青岛海洋化工厂生产)；InfiniteM200酶标仪。所用试剂为杭州市双林试剂厂分析纯和色谱纯产品。

2、提取和分离

首先确定冷浸提取狐尾藻的乙醇浓度为95%，然后取干燥狐尾藻2Kg，干燥黑藻1.05Kg，干燥金鱼藻0.61Kg，苦草0.4Kg剪碎，用95%的乙醇冷浸提取三次。将提取液用真空减压浓缩后得到狐尾藻浸膏780g，黑藻浸膏56g，金鱼藻浸膏36g，苦草浸膏25g。

选取的装柱方法为湿法装柱，上样方法为干法上样。在石油醚的液面高于硅胶2cm时加入样品，上样完成后注意要在层析柱内的样品干粉上铺上一层硅胶，以防止加入洗脱剂时将样品冲起。

得到的狐尾藻浸膏加入适量的蒸馏水溶解，可使用超声机将浸膏分散到水中。并在分液漏斗中中用石油醚进行反复的萃取，直到石油醚层溶液的颜色变为无色。之后，将之前所有用石油醚萃取的溶液合并，再次浓缩。得到浸膏90g；将上一步石油醚萃取之后留下的那部分，使用乙酸乙酯进行反复萃取，直到乙酸乙酯层的颜色变为无色。操作与上一步石油醚萃取操作相同。将得到的乙酸乙酯萃取液合并，再次浓缩得到浸膏50g。

3.总黄酮含量测定

表3.1四种藻类及狐尾藻乙酸乙酯部位、石油醚的吸光度及其总黄酮百分含量

分别依次取一定量的样品溶液，然后在510nm波长处对其进行波长测定，记录吸光度的数值，结果是在2mL的取样量下，会有最佳的吸光数值。四种藻类都含有一定的黄酮类化合物[1、2]；总黄酮化合物含量最多的狐尾藻，最少的为黑藻。黄酮类化合物具有抗菌及抗病毒活性、抗氧化自由基活性、降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、泻下、镇咳、祛痰、解痉及抗变态等药理活性[3]。据此可以推测藻类应该具有抗菌等药理活性，可深入研究应用在医药学领域。

4.抗氧化活性分析

4.1DPPH抗氧化能力：

黑藻、金鱼藻、苦草和狐尾藻四种藻类，自由基清除率在样品浓度为8mg/ml都是最高的。在一定的样品浓度范围内，狐尾藻、黑藻和金鱼藻自由基清除率是随着样品浓度的升高而逐步升高，越来越好[4]。而苦草自由基清除率在样品浓度为4mg/ml--8mg/ml是呈正比关系，在样品浓度为4mg/ml有点特殊。在低浓度情况下，苦藻的自由基清除率是最高的，可能与苦藻的生长环境有关，苦藻生长在河道底部，接受光照较少，根系较发达。

4.2总还原能力

黑藻、金鱼藻、苦草和狐尾藻四种藻类，自由基清除率在样品浓度为8mg/ml都是最高的，接近100%。在一定的样品浓度范围内，狐尾藻、黑藻和金鱼藻自由基清除率是随着样品浓度的升高而逐步升高，呈线性增长。从横向对比狐尾藻各个部位的总还原能力相类似，呈平行的状态。越来越多的研究显示抗氧化是预防衰老的重要步骤，因为自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响代谢功能，并会引起不同的健康问题。如果能够消除过多的氧化自由基，对于许多自由基引起的及老化相关疾病都能够预防。例如常见的癌症、动脉硬化、糖尿病、白内障、心血管病、老年痴呆、关节炎等，这些疾病都被认为与自由基相关[5]。

4.3Fe2+离子螯合能力：

Fe2+滴定法相对标准偏差最小，操作简单、方便且不受放置时间、样品本身颜色的影响，在与Fe2+反应的过程中体系颜色(黄色)逐渐加深，从而影响滴定终点(亮黄色)的判定；其次，此法受样品颜色的影响，故结果相对偏高。其由上图可以看出黑藻的Fe2+离子螯合能力最强，狐尾藻的石油醚跟乙酸乙酯部位与狐尾藻都有部分类似或重合。可以看出不同的藻类之间黑藻的Fe2+离子螯合能力与其他藻类相比要强的多，这一结果与总黄酮含量相反；狐尾藻各部位的Fe2+离子螯合能力比较相近，说明样品部位对Fe2+离子螯合的能力影响不大。

4.4超氧自由基（O2-）清除率：

从图4.4可以看出样品不但不能有效清除超氧阴离子自由基，反而能促进其生成，可能原因是由于被测物质体系中含有与产生超氧阴离子自由基物质—邻苯三酚相似的物质，从而促进了超氧阴离子自由基的产生[6]。

5.藻类应用价值

5.1生态环境价值

藻类作为园林水景植物或河道生态治理的先锋物种，具有较好的观赏、生态和经济价值。目前，在实际应用中，如狐尾藻、凤眼莲、芦苇等在氧化塘和人工湿地中主要靠根部的吸收功能进行废水处理[7]，还缺乏对其科技和生态的深入研究。需要加深科研机构和高校对其进行研究和推广，对其多重价值要高度重视和拓深挖掘。

5.2药用价值

现今，人类在藻类中提取了对于治疗高血脂、高血压等一些常见疾病的有效物质。既然藻类能够对污水有如此的净化效果，我想必定存在对治疗疾病的物质。我们通过冷浸提取，梯度萃取等实验手段，分离出多种未知物质。并对这些样本进行研究分析。通过数据来得出其对于常见病症效果的分析。比如说未知物质具有强氧化性，或者是强还原性，还含有黄酮类化合物、蒽醌类化合物等。

参考文献

[1]张德权，台建祥，付勤.生物类黄酮的研究及应用概况[J].食品与发酵工业.1999(06)

[2]陈学丽，叶立斌，励建荣，孙金才，陈卫，许庆炎.杨梅渣黄酮类化合物提取及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技.2011年02期.

[3]赵瑞芝，欧润妹，章新生.不同提取方法对大黄游离蒽醌含量及其抑菌活性影响的研究.中国药学杂志，2001;36(7):483.

[4]魏玉西，于曙光.两种褐藻乙醇提取物的抗氧化活性研究.海洋科学.2002:49-51

[5]钱卓权，殷皓臻，黄晓林，林少珍，南海函.三种海藻抑菌活性和抗氧化活性.浙江农业学报.2014,26(2):384-387

[6]韩少华，朱靖博，王妍妍.邻苯三酚自氧化法抗氧化活性的方法研究.中国酿造.2009（6）:155-156

[7]鲁将，胡栋.狐尾藻的养殖与应用研究.中国园艺文摘.2016，第四期：225-226