过表达SCD-1对β淀粉样蛋白1-40诱导的巨噬细胞膜脂的影响

过表达SCD-1对β淀粉样蛋白1-40诱导的巨噬细胞膜脂的影响

单晶丽（通讯作者）隋丹姚秀彬

单晶丽（通讯作者）隋丹姚秀彬

（哈尔滨市第二医院神经康复科黑龙江哈尔滨150001）

【摘要】目的探讨SCD-1过表达对Aβ1-40诱导的巨噬细胞膜脂的影响。方法用带有SCD-1的腺病毒表达载体pcDNA3,通过腺病毒转染，使其在巨噬细胞中过表达。检测未干预组及过表达组巨噬细胞膜脂成分及细胞膜流动性的改变。结果过表达组巨噬细胞中巨噬细胞膜主要的磷脂成分降解(P<0.05);细胞膜荧光偏振度(ρ)、微粘度(η)和分子排列有序性系数(γ)增加(P<0.05)。结论过表达SCD-1可增加Aβ1-40诱导的巨噬细胞膜的稳定性。

【关键词】过表达SCD-1巨噬细胞β淀粉样蛋白

【中图分类号】R741【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）32-0138-02

EffectsofoverexpressionofSCD-1onmacrophagemembraneinducedbyamyloidbetaprotein1-40grease

(SHANJing-li,SUIDan,etal.(DepartmentofNeurology,TheSecondClinicalHospitalofHarbin,Harbin150001,China)

【Abstrac】ObjectiveToobservetheeffectsofStearoyl-CoAdesaturease-1(SCD-1)overexpressiononChangesofmembranephospholipidsinmacrophagesinducedbyβ-amyloidprotein(Aβ).MethodstheexpressionvectorpcDNA3withSCD-1adenovirus,byadenovirustransfection,anditsoverexpressioninmacrophages.Flowdetectionuntreatedgroupandoverexpressionofmacrophagemembranelipidcompositionandgroupcellmembranechanges.Resultstheexpressionofmacrophagemembranephospholipiddegradationinmacrophagesinthemaingroup(P<0.05);cellmembranefluorescencepolarization(P),microviscosity(η)andthemolecularorderingcoefficient(γ)increased(P<0.05).ConclusionSCD-1canincreasetheexpressionofmacrophagemembranestabilityofAβ1-40.

【Keywords】OverexpressionSCD-1macrophageβ-amyloidprotein

阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是一种常见的慢性进行性精神功能衰退性疾病[1]。主要症状为进行性记忆力和认知力减退、言语障碍、精神运动异常等症状。确切发病机制目前还不清楚，目前已积累的资料有力的证实，胆固醇在Aβ的产生和沉积过程中起重要作用，Aβ沉积进而导致AD的发生。但脂肪酸与AD的研究尚少见。硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(SCD-1)是肝细胞中单不饱和脂肪酸（MUFA）合成的限速酶，其首选底物是软脂酰和硬脂酰辅酶A,分别转化生成油酸与棕榈油酸。近年来研究者发现SCD-1在调控脂肪酸代谢、维持能量平衡、调节胰岛素敏感性及衰老与寿命方面都发挥着重要作用[2]。另有研究显示神经元可表达SCD-1，星形胶质细胞由于能合成油酸，因此也可能表达SCD-1。这些均提示SCD-1可能在AD的发病机制中发挥重要作用，但迄今为止国内外尚无SCD-1与阿尔茨海默病(AD)关系的直接研究。我们通过体外培养巨噬细胞，用带有SCD-1的腺病毒表达载体pcDNA3,通过腺病毒感染，使其在巨噬细胞中过表达，检测巨噬细胞膜脂的变化，初步探索SCD-1与AD的相关性。

1材料与方法

1.1实验细胞

Ana-1，小鼠巨噬细胞，由上海中科院细胞库提供。含PMPIMedium(1640)培养液+10%FBS+1%双抗培养巨噬细胞，37℃、5%CO2恒温孵育箱孵育，隔日更换培养液，每周传代1-2次。状态良好的巨噬细胞成簇悬浮生长，单个细胞为圆形，饱满，大小均等，使用前需离心。

1.2pcDNA3-SCD-1重组质粒为本课题组先前构建

根据SCD-1基因的cDNA全长序列,设计一对包含SCD-1全编码序列的PCR引物并分别引入BamHI-XhoI酶切位点;从巨噬细胞提取总RNA,RT-PCR法扩增,扩增片段长度为1960bp;定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经测验证,表明插入片段序列和ORF正确无误。020211

1.3方法

1.3.1巨噬细胞膜磷脂测定[3]用毛细管电泳法测定细胞膜磷脂成分,分别为磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC),磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE),磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserinePS),磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)。

1.3.2巨噬细胞的瞬时转染将溶液a(溶解质粒2μg于HBS溶液中,终体积25μL)和溶液b(溶解DOTAP15μL于35μLHBS中)温和混匀,室温放置10～15min,即为DOTAP/核酸混合物,温和的将DOTAP/核酸混合物与1mL无抗生素培养基混匀,即为转染混合液，巨噬细胞于35mm培养皿中培养,待细胞生长至60%～80%汇合;吸弃旧培养基,将转染混合液加入培养皿中,培养箱温育6h;吸弃培养基,直接加入无抗生素的新鲜培养基,继续培养48h后收获细胞,即可进行各种检测。

1.3.3RT-PCR检测SCD-1mRNA表达水平:SCD-1扩增引物(扩增产物302bp):Senseprimer:5'-CATACCTCGCACTTCAAGCA-3'(20mer)Antisenseprimer:5'-TTTGTAGCCGATGGATGTGA-3'(20mer)内参照GAPDH扩增引物(扩增产452bp):Senseprimer:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'(20mer)Antisenseprimer:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(20mer)引物由上海生工生物工程有限公司合成,Trizol法提取细胞总RNA,采用M-MLVReverseTranscriptase试剂盒进行反转录,PCR反应条件:95℃2min变性后,按下列热循环参数94℃30s,57℃30s,72℃30s进行30个循环,最后72℃延伸10min,PCR产物经0.8%琼脂糖(含0.5μg/mLEB)电泳,紫外透射仪观察拍照。

1.4统计学分析

所测数据以表示，两组间均数比较用t检验，p<0.05时差异有统计学意义。

2结果

2.1重组载体在巨噬细胞中表达水平的鉴定

RT-PCR检测SCD-1mRNA表达:转染pcDNA3-hSCD-1后,细胞内SCD-1基因mRNA水平较未转染细胞明显增高(图1)。

2.2巨噬细胞膜脂改变

与正常对照组小鼠相比,过表达SCD-1后小鼠巨噬细胞膜主要磷脂组分已经降解,PC、PE、PI含量显著减少(P<0105)(表1)。

表1过表达SCD-1对小鼠巨噬细胞膜磷脂的影响,μg/107cells

(注:*与对照组比较p<0.05)

3讨论

Alzheimer病（AD）是一种中枢神经系统慢性、退行性疾病，以进行性记忆减退和认知障碍为主要临床特征。其发病率逐年升高，造成严重的医学问题与社会问题[4]。因此AD的发病机制与治疗的研究日益重要，国内外学者均提出要重视AD的分子机制与治疗靶点的研究。

近来有关报道认为,许多饮食成分和食物与AD的发生发展有关[5]。这些因素包括脂肪类、脂肪酸类、抗氧化剂类、鱼类、维生素类等。对于AD来说,脂质代谢和脂肪酸代谢是最重要的,其标志物载脂蛋白E(APOE)-ε4等位基因是AD最重要的遗传危险因素。存在一个ε4等位基因拷贝(片段)危险性就增加2～3倍,而那些具有2个ε4等位基因的危险性是不具有ε4等位基因的危险性的12～15倍[6]。SCD-1与脂质,特别是三酰甘油的合成有密切关系。Lee等通过对雄性与雌性大鼠的SCD-1mRNA表达丰度和血浆脂肪酸水平进行比较,发现雌性大鼠SCD-1mRNA的表达显著高于雄性大鼠,同时雌性大鼠软脂油酸盐和油酸甘油酯的水平也增高。靶向破坏SCD-1基因后,大鼠三酰甘油和胆固醇酯的的合成受损,VLDL水平降低。可见，SCD-1在脂类代谢中有很重要的作用。研究表明，诱导SCD-1激活会增加胆固醇、血浆脂质和脂蛋白的增加，进而导致心脑血管疾病。据1999年5月美国神经学学会出版《神经学》杂志发表的一个研究表明，高单不饱和脂肪酸膳食能防止人们随着年龄增长所带来记忆和认知功能下降。这是因为单不饱和脂肪酸是神经元细胞膜组成成分，它能完成神经元细胞膜完整性缘故[7]。细胞生物膜性脂质的正常组成除了维持细胞膜的流动性、液态性和通透性外,与神经细胞的功能密切相关,如细胞的信号传导、酶活性、受体结合及离子通道等。近年来的研究发现,AD患者脑细胞膜脂质成分存在一定程度的改变,表现为细胞膜磷脂水平及多不饱和脂肪酸水平降低[8]。可见，不饱和脂肪酸与神经细胞的功能密切相关，神经细胞中MUFA的减少可破坏细胞膜的完整性，一旦神经细胞膜的完整性遭到破坏，势必会增加患AD的风险，由此可以推断MUFA合成的限速酶SCD-1可能在AD的形成过程中起作用。

过表达SCD-1巨噬细胞膜主要的磷脂成分降解，细胞膜荧光偏振度(ρ)、微粘度(η)和分子排列有序性系数(γ)增加。然而，SCD-1在巨噬细胞中的作用仍然未知，而且，没有研究显示SCD-1与AD有直接的联系。尽管其具体机制仍然未知，但本实验证实过表达SCD-1可增加Aβ1-40诱导的巨噬细胞膜的稳定性，通过Aβ可以建立SCD-1与AD的联系桥梁，SCD-1可能是AD发病机制的一个环节。

参考文献

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[7].张伟敏，钟耕，王炜.单不饱和脂肪酸营养极其生理功能研究概况，粮食与油脂.2005，（3）：13-15.

[8].Kinsella,J.E.,Lokesh,B.,Stone,R.A.Dietaryn;C3polyunsaturatedfattyacidsandameliorationofcardiovasculardisease.Am.J.Clin.Nutr.1990，52:1-28

（黑龙江省卫生厅科研课题编号2010-376）

附图

图1RT-PCR检测SCD-1基因的转录水平

Fig1IdentificationoftheSCD-1transcriptionbyRT-PC

lane1.transfectedcells;lane2.controlleduntransfected

cells;lane3.100bpladder