缺氧预处理后Akt/eNOS在未成熟脑海马的表达特点

缺氧预处理后Akt/eNOS在未成熟脑海马的表达特点

张伟然

浙江大学医学院附属儿童医院310031

摘要：目的研究缺氧预处理后未成熟脑海马中Akt/eNOS表达的时间及空间特点。方法：选择新生SD大鼠40只，其中空白对照组（Control组）10只，缺氧预处理组（PC组）30只，PC组分为缺氧结束后0h，1h，4h，8h，24h取5个时间点处死大鼠，每个时间点及Control组各取5只断头取脑分离海马，Westernblot检测分析pAkt、Akt、eNOS及peNOS的表达特点；Control组、PC处理24h各取5只，断头取脑，制作冰冻切片，行免疫荧光检测pAkt分布。结果缺氧预处理后大鼠海马区内pAkt（磷酸化的Akt）在复氧时已经有明显增高，之后略有降低，4h后再次升高，24h仍维持较高水平；Akt表达基本无明显变化。eNOS表达水平在复氧后逐步升高，peNOS（磷酸化的eNOS）表达趋势与eNOS基本一致。免疫荧光检测结果表明PC后24h血管内皮细胞pAkt表达水平明显增高。结论缺氧预处理后24小时新生大鼠海马pAkt及eNOS表达水平升高，其中以血管内皮细胞变化最明显。

关键词：Akt；血管内皮型一氧化氮合酶；缺氧缺血性脑损伤；缺氧预处理；认知功能

1、前言

缺氧是全身多种疾病发病过程的一个非常重要的病理因素，缺氧预处理的脑组织能对随后的严重缺血耐受性明显增强[1]。PI3K/Akt信号通路是一个经典抗凋亡、促存活信号转导途径，在缺血脑保护、新生血管的生成、抗凋亡等方面发挥重要作用[2]。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在血管生成和血管紧张度中起重要作用，缺氧预处理能提高血管和星形胶质细胞中的eNOS水平。我们应用出生6天的SD大鼠进行缺氧预处理，分析缺氧后未成熟脑海马中Akt/eNOS表达的时间及空间特点。

2、实验材料和方法

2.1主要仪器与试剂

测氧仪，密闭缺氧箱，混合气体（92%N2+8%O2），多功能酶标定量测定仪，激光共聚焦扫描显微镜（LSM-510），低温离心机，超声细胞破碎仪。RIPA组织细胞裂解液，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，辣根过氧化物酶标记小鼠看大鼠β-actin，彩色预染蛋白质分子量标准，磷酸化兔抗大鼠p-Akt多克隆抗体，兔抗大鼠AKT多克隆抗体，辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG（H+L），辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L），荧光标记番茄凝集素（Lctin）。

2.2方法

2.2.1动物模型的制备

浙江大学紫金港动物实验中心出生6天的新生SD大鼠40只，分为空白对照组（control组）（n=10）和缺氧预处理组（PC组）（n=30）。control组置37℃水浴环境，供正常大气。PC组将大鼠置于自制缺氧舱内，该缺氧舱置于37℃电热恒温水浴中，大鼠先在缺氧舱内适应10分钟，向缺氧舱内按1～2L/min的速度输人体积浓度为8%氧气和92%氮气的混合气体，缺氧时间持续2小时。缺氧结束后，大鼠回笼继续由母鼠母乳喂养。缺氧结束后0h，1h，4h，8h，24h取5个时间点处死大鼠，每个时间点及control组各取5只断头取脑分离海马，Westernblot检测；

2.2.2Westernblot免疫印迹

提取脑海马组织总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭抗体、一抗孵育（一抗用封闭液稀释，兔抗大鼠AKT抗体1：1000、兔抗大鼠p-Akt抗体1：1000、兔抗大鼠eNOS抗体1：1000、兔抗大鼠peNOS抗体1：1000）、二抗孵育、化学发光步骤进行，根据曝光的情况调整曝光时间，胶片清洗后晾干。用底片扫描仪扫描x光胶片后，用imageJ2.1图像分析系统对x光胶片上的条带进行灰度分析，采用目的蛋白条带与内参照β-actin条带灰度值的比值作为结果，以此表示目的蛋白的表达水平。

2.2.3免疫荧光组织化学反应

将脑组织切片1×PBS漂洗，封闭液（10%驴血清+1%BSA）封闭1hour；滴加p-Akt兔抗大鼠多克隆抗体（1：400）4℃孵育过夜；漂洗后加入二抗AlexaFluor594DonkeyAnti-RabbitIgG（1：1000）孵育60mim；漂洗、阴干；加抗荧光淬灭封片液（添加DAPI）封片；荧光显微镜及激光共聚焦显微镜下观察。

2.2.4统计学方法

实验数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，多组组间的显著性差异检验应用单因素方差分析（One-WayANOVA），继以LSD法两两比较。两两比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有显著性意义，在SPSS17.0统计软件上完成。

3结果

3.1WesternBlot检测缺氧预处理后海马Akt及eNOS的表达情况

缺氧预处理组海马区内pAkt在复氧时已有明显增高，之后略有降低，4小时后再次升高，24小时仍维持较高水平，与空白对照组比较，差异有显著性意义（P<0.01）；Akt表达基本无明显变化，与空白对照组比较无统计学意义（P>0.01）。eNOS表达水平在复氧后逐步升高，24小时仍维持在较高水平，peNOS表达趋势与eNOS基本一致，在4h，8h，24h蛋白表达量与空白对照组比较差异有显著性意义（P<0.01）。

4讨论

缺氧缺血、低温，甚至一些药物均可以作为预处理手段，诱导脑缺氧缺血耐受的发生。对于预处理效应机制的研究经历了由大体水平到细胞水平再到分子水平的发展过程，在信号转导系统中P13K/Akt信号通路在缺氧缺血预处理过程中发挥重要作用，PI3K/Akt通路是一个经典抗凋亡、促存活的信号转导途径，Akt蛋白处于P13K/Akt信号转导途径的核心部位，研究发现多种心肌保护手段及药物通过激活Akt而减轻缺血/再灌注损伤。我们按文献[3]方法将出生6天的新生大鼠置于8%氧气、92%氮气的低氧环境中2小时造成缺氧预处理模型，发现新生6日龄大鼠经低氧处理后海马区内pAkt在复氧时已经有明显增高，之后略有降低，4小时后再次升高，24小时仍维持较高水平，Akt表达基本无明显变化。因此缺氧预处理后磷酸化的Akt表达增加。

NO对缺氧缺血性脑损伤有一定的保护作用，NO由L-精氨酸在一氧化氮合酶（NOS）作用下生成，NOS主要有三种形式，其中eNOS主要存在于血管内皮细胞中，实验中也发现缺氧预处理诱导了血管内皮细胞上pAkt的高水平表达，缺血再灌注损伤及低氧时，作为机体的一种代偿性的保护，eNOS表达上调。本实验中研究发现eNOS表达水平在复氧后逐步升高，peNOS表达趋势与eNOS基本一致。因此缺氧预处理后，海马内Akt/eNOS的表达及磷酸化水平发生显著变化，提示其在缺氧预处理后对海马HIBD损伤的保护机制中可能有重要作用。

有研究表明血管内皮细胞Akt信号通路通过对eNOS的表达及磷酸化的调控，参与脑组织缺血再灌注损伤的调控。为明确PC后血管内皮细胞内pAkt的表达情况，我们应用血管内皮细胞标记结合免疫荧光染色技术，观察了PC后海马区血管内皮细胞pAkt的表达水平，发现缺氧预处理海马区血管内皮细胞pAkt表达明显升高。本实验提示血管内皮细胞Akt/eNOS通路可能在PC保护海马HIBD损伤的机制中有重要作用。

参考文献：

[1]丁爱石，王福庄，吴丽颖，等.低氧预适应可减少缺氧一复氧后大鼠海马培养神经元凋亡.神经解剖学杂志，2000.16（1）：7-10.

[2]Choi，J.S.，etal.PhosphorylationofPTENandAktinastrocytesoftherathippocampusfollowingtransientforebrainischemia.CellTissueRes，2005.319（3）：p.359-66.

[3]Wada，T.，T.KondohandN.Tamaki，Ischemic"cross"toleranceinhypoxicischemiaofimmatureratbrain.BrainRes，1999.847（2）：p.299-307.