ELISA法检测乙肝表面抗原实验精密度研究

ELISA法检测乙肝表面抗原实验精密度研究

陆中奎

陆中奎（广东省佛山市顺德区龙江医院检验科528319）

【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）29-0014-03

【摘要】目的探讨ELISA法检测HBsAg实验精密度的影响因素及实验精密度对检验结果的影响。方法检测卫生部临检中心0.5ng/mL质控血清，计算精密度；比较手工操作与全自动酶免分析仪法检测的精密度；检测不同效价的阳性血清，比较精密度，并作统计学分析。结果临界值附近的标本可能引起误判，手工操作与全自动酶免分析仪法检测实验精密度差异有统计学意义(ｔ=4.72，Ｐ<0.01)。结论实验精密度的高低对酶免法检测HBsAg实验存在影响，检验结果的判定应设置灰区并进行复检或进一步检测。

【关键词】乙型肝炎表面抗原ELISA法检测

一前言

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝脏性损害，是我国当前最广泛、危害最严重的一种传染病。经济发展的水平较底，卫生条件比较差是本病流行的基础。本病遍及全球，乙肝表面抗原携带率，热带地区高于温带，男性高于女性，在未经免疫预防的国家里，儿童携带率高于成人，城市高于农村。传染源主要是患者及乙肝病毒无症状携带者、经血液、性接触和生活密切接触都是传播的重要方式。易感者感染乙肝病毒后约经三个月（6周至6个月）发病。临床表现为、食欲减退、恶性、呕吐、厌油、腹泻及腹章涨，部分病人有发人发热、黄疸，约有半数患者起病隐匿，在查体中发现。肝功能异常，血清乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒脱氧合糖核酸（HBVDNA）、乙肝病毒免疫球蛋白M(HBVIgM)、脱氧核糖核酸聚合酶均为阳性。大部分乙肝病人经治疗后临床症状能消退，少数病程迁延或转为慢性，其中一部分可发展为肝炎后肝硬变甚至肝癌;及少数病人病程发展迅猛，肝细胞出现大片坏死，成为重型肝炎；另有一些肝炎感染者则成为无症状的病毒携带者。

实验研究表明，乙肝表面抗原（HBsAg）与乙型肝炎的发生有着密切的关系。因为它是HBV的外壳蛋白，本身虽然不具有传染性，但它的出现常常伴随着HBV的存在，所以它是人体已经感染上HBV的标志。HBsAg存在于患者的血液、唾液、乳汁、泪液、汗腺、鼻咽分泌物、阴道分泌物及精液之中，人体在感染乙肝病毒2～6个月后、当转氨酶升高前2～8周时，可在血清中检测到阳性结果。乙肝表面抗原阳性持续时间一般较长，个别可长达20多年。

HBsAg阳性为HBV感染的标志。如果肝功能及其他HBV感染指标均正常而仅仅HBsAg阳性，且未见任何症状与体征的话，则可能为HBsAg携带者或既往得过乙肝，现肝功已恢复正常，唯HBsAg尚未转阴而且。临床可根据HBs－Ag滴度的高低估计患者传染性的大小。所以乙肝表面抗原（HBsAg）的检测具有非常重要的意义。

ELISA法检测HBsAg因其快速、简便、成本低、便于大规模全自动仪器操作等特点，已被各实验室广泛应用。目前，临床实验室检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基本采用ELISA法，由于ELISA法的影响因素较多，尤其是临界值(cutoff)附近标本结果吸光度(Ａ值)易波动而引起误判，影响结果的可靠性。ELISA法的精密度(precision)是反映实验结果可靠程度的重要指标，精密度是指对同一样本重复测定，每次测定结果和均值(x-)接近的程度，常以标准差(ｓ)或变异系数(CV)表示。本试验分别应用手工操作法与全自动ELISA分析仪法对卫生部临检中心0.5ｎｇ/ｍｌ质控血清3种不同效价梯度的阳性血清检测，并比较实验精密度，进行统计分析，探讨ELISA检测ＨＢsＡg实验精密度的影响因素及精密度对检验结果的影响。

二材料与方法

1.检测对象:HBsAg0.5ng/mLl质控血清购自卫生部临检中心;HBsAg室内质控血清(本室自制)；经确证的HBsAg阳性血清1支。

2.室内质控血清制备:收集HBsAg阳性血清4份，经56℃10ｈ灭活,用PH值7.4的PBS缓冲液稀释，加入20%小牛血清补充蛋白，用3种厂家试剂检测均为阳性。

3.仪器：全自动加样仪(Microlabstar)、全自动酶免分析仪(MicrolabFAME)购自瑞士Hamilton公司。

4.试剂:市售国产试剂，贴有中国药品生物制品检定所防伪标记，批批检定合格，有效期内使用，严格按说明书操作。

5.方法：(1HBsAg)实验精密度：对卫生部临检中心0.5ｎｇ/ｍｌ质控血清，连续测定20次，以每孔Ａ值相对于cutoff值的比率(S/CO),(S/CO≥1结果为阳性，计算x-、ｓ、ＣＶ。(2)手工操作法与全自动酶免分析仪法精密度比较：手工加样，严格按试剂盒内说明书手工完成整个实验;MicrolabstarFAME全自动加样及检测，包括标本试剂的加样、稀释液的分配、洗板、孵育、读板、结果发送，实验的各个环节都在电脑控制下完成。连续测定室内质控血清20次，以每孔Ａ值相对于cutoff值的比率(Ｓ/ＣＯ)，计算x-、ｓ、ＣＶ,并对实验结果进行综合分析比较。(3)对不同效价梯度阳性血清的检测精密度比较：将阳性血清稀释为不同效价梯度，分别连续测定20次，以每孔Ａ值相对于cutoff值的比率(Ｓ/ＣＯ)，计算χ、ｓ、ＣＶ,并对实验结果进行综合分析比较。(4)统计学方法：采用ｔ检验。

三结果

1.测定卫生部临检中心0.5ｎｇ/ｍｌ质控血清结果：连续测定20次质控血清，以Ｓ/ＣＯ计算x-=1.12,ｓ=0.14,ＣＶ=11.9%，结果见表1。

2.手工操作法与全自动酶免分析仪法精密度比较，结果见表2。

四讨论

影响ELISA实验效果的因素主要有两个方面，首先是试剂盒的质量，其次是试剂盒的使用情况。应用高质量的试剂是ELISA实验结果准确可靠的根本保证。我国ELISA免疫诊断试剂盒自问世以来，试剂盒的水平已有很大提高，由表1可以看出,cutoff值附近标本的结果易波动，会出现“时阴时阳”的现象。所以，为保证实验结果准确可靠，应选择精密度高的试剂，试剂应用前实验室应先进行综合评价。试剂盒的使用情况即对试剂盒的操作过程，这一过程的成功与否直接影响着试剂盒的检测水平的发挥。因此，在完全按照试剂盒操作要求的前提下，均一、稳定的操作过程和实验条件是获得最佳实验结果的必要条件。由于ELISA实验需要多次加样、孵育、洗涤等步骤，影响实验因素较多，全自动酶免分析仪在均一、稳定的状态下进行，避免了手工操作由于人为因素而引起的误差，从而保证了实验结果的可靠性。从表2可以看出，全自动酶免分析仪的实验精密度高于手工操作。常规实验中的手工操作，由于操作手法的不均一性，造成检测结果变异过大，影响了实验的精密度；而全自动酶免分析仪以自动化、标准化的操作手段使实验达到了全过程控制和全过程标准化分析，大大提高了实验的精密度，使检测结果更趋稳定，从而保证了实验结果的可靠性。理想的ELISA实验结果为阴性或阳性，但从表3可以看出，由于检测试剂的孔间变异使检验结果的重复性不好，致使cutoff值附近的标本介于阴性或阳性之间。所以，为了保证检测结果准确可靠,建议试剂盒使用前最好作孔间变异调查，根据孔间ＣＶ来推测样品的可能变动范围，设置低限灰区。因为国产HBsAg试剂盒的cutoff值一般以阴性对照值乘以一个常数得出，阴性对照是小牛血清而非人血清，Ａ值不超过0.05即按0.05计算,亦即cutoff值为一不变的常数，这样就忽视了试剂批间差、板间差和操作误差。研究表明，灰区内标本确实存在着病毒复制，设置灰区后，可进一步减少HBsAg漏检的可能性，但同时不可避免地造成假阳性率的增高,给患者造成一定的精神负担。ELISA精密度的高低对其检测结果的阴性、阳性判定有影响,从表3可以看出，样本Ａ值越小,ＣＶ值就越大。cutoff值附近的标本有可能引起误判，故对灰区标本，应进行重复测定或者进行核酸扩增试验再出报告。综上所述，为保证实验结果的准确可靠，首先应选用高质量、高精密度的试剂。实验的操作水平会影响到实验的精密度,应用全自动酶免分析系统可以提高实验的精密度，从而保证检测结果的可靠性，同时，精密度的高低可能影响实验结果的判定，对于灰区标本应进行重复测定,以免造成误检。

参考文献

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