独一味颗粒的微生物限度检查法的研究

独一味颗粒的微生物限度检查法的研究

崔岩

崔岩

（辽宁省朝阳市药品检验检测所辽宁朝阳122000）

【摘要】建立独一味颗粒的微生物限度方法。按《中国药典》2010年版微生物限度检查法进行验证和试验。经方法学验证试验得出的检查方法可用于独一味颗粒的微生物限度检查。

【关键词】独一味颗粒；微生物限度检查；方法学验证

【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）21-0353-02

TheValidationofMicrobiologicalTestforDuYiWeikeli

CuiYan(DrugControlInstituteofChaoyangCityinLiaoningProvince,122000

【Abatrct】ThemethodofmicrobiallimittestforDuYiWeikeliwasestablished.AccordingtothemethodofmicrobiallimitonEdition,2010ofChinesePharmacopoeia.ThevalidationtestresultsshowedthatthemethodcouldbeusedformicrobiallimittestforDuYiWeikeli

【Keywords】DuYiWeikeli;Microbiallimittest;Validationtest

中药口服制剂容易受到微生物的污染，因此微生物限度检查是《中国药典》2010年版一部中药丸剂必检项目，是微生物污染状况控制的重要指标。当建立的微生物限度检查法时，应进行方法学验证，以确定所采用的方法是否适合该产品，使检验结果更具有有效性。因此本文通过对辽宁朝阳龙城制药厂提供的独一味颗粒不同批次进行了微生物限度检查法的验证，从而确定了该品种的微生物限度检查法。

1.仪器与材料

1.1仪器生物安全柜（BHC-1300ⅡA2），生化培养箱（SHP-150），隔水培养箱（JC303-3B）。

1.2培养基和稀释液营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）。稀释液：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，按要求配制，灭菌。

1.3菌种大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌（Baillussubtilis）[CMCC（B）63501]、白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]和黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]均由中国药品生物制品检定所提供。

2.方法

2.1菌液制备菌液制备：接种大肠埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

菌悬液制备后，若在室温下放置应在2h内使用，若保存在2～8℃的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉菌的孢子悬液保存在2～8℃，可在存储期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。

2.2供试液制备：取10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,振摇，制成1:10的供试液。取1:10的供试液1ml,加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1:100的供试夜；取1:100的供试液1ml,加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1:1000的供试夜。

2.3细菌、霉菌和酵母菌计数的验证实验

2.3.1常规平皿法

供试液制备：依据《中国药典》2010年版一部附录“微生物限度检查法”中供试液制备法：取本品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，作为1:10的供试液。

（1）试验组分别取1:10供试液1ml和50～100cfu试验菌，注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

（2）菌液组：取1ml上述制备的菌液，加入相应的培养基培养，测定所加的试验菌数

（3）供试品对照组：分别取1:10供试液1ml，按平皿法测定其菌数。

（4）稀释剂对照组：取稀释液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，按平皿法测定其菌数。

测试结果如下表：

表1

菌株类别三组实验稀释剂对照组的菌数回收率%试验组的菌数回收率%

试验组平均菌落数cfu/ml菌液组平均菌落数cfu/ml稀释剂对照组平均菌落数cfu/ml供试品对照组平均菌落数cfu/ml

大肠埃希菌7780810101.2%96.2%

金黄色葡萄球菌667270097.2%91.7%

枯草芽杆菌717975094.9%89.9%

白色念珠菌636865095.6%92.6%

黑曲霉566260096.8%90.3%

由以上表格数据可知，在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率均大于70%，试验组的菌数回收率也均大于70%，证明照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌数方法可行。

所以，独一味颗粒的细菌、霉菌和酵母菌计数采用常规平皿法。

2.4控制菌检查验证

2.4.1试验组：

2.4.1.1大肠埃希菌：供试液的制备：取本品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用研钵混匀，作为1:10的供试液。取供试液10ml与每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，取培养物0.2ml接种至含5mlMUG培养基的试管内培养，观察荧光及靛基质试验。观察结果：MUG阳性，靛基质阳性，检出大肠埃希菌。

2.4.1.2阳性对照组：取10～100cfu大肠埃希菌加入相应的增菌培养基中，按试验组方法进行检查。

2.4.2阴性菌对照组：取稀释液替代供试液，按试验组方法进行检查。

结果：阳性对照组检出试验菌，阴性对照组没有菌生长，试验组检出试验菌，所以独一味颗粒的控制菌检测方法可以按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的控制菌检查。。

3.结论

3.1细菌、霉菌和酵母菌计数方法采用常规平皿法测定。

3.2大肠埃希菌按常规法进行控制菌检查。

3.3注意不同的培养时间对样品细菌总数计数结果的影响样品经24h培养后，有的菌落很小，容易漏掉，培养48h后，菌落不但变大，而且还有很多新生长出来的菌落，培养72h后，菌落数增加不多，但菌落明显变大，而且混杂的霉菌生长旺盛，影响结果的观察计数。同时这也是一些样品经72h培养后细菌总数技术有明显增加的一个原因。培养24h和培养48h计数结果有明显差异，所以在规定的培养环境下，应严格遵守培养时间，以便真实的反映出样品中细菌总数的水平。

【参考文献】

[1]《中国药典》2010年版一部：Apendix附录XIIIC:79-88

[2]特玉香，曹艳玲，林丽英等.十全大补丸微生物限度检查方法验证.药物分析杂志，2008,28（6）：932

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[4]李近磊，王嘉怡，迟丹怡等.复方克林霉素凝胶微生物限度检查法的方法验证研究.中国药房,2010,25:2380-2382

[5]刘淑娟，冯梅.金莲清热颗粒微生物限度检查法验证.北方药学，2014，10：10-11