L-myc基因EcoRI限制性内切酶长度多态性在

L-myc基因EcoRI限制性内切酶长度多态性在

杨春平（通讯作者）赵广平贾雨新史建国朱小波

杨春平（通讯作者）赵广平贾雨新史建国朱小波

（江苏省溧阳市人民医院213300）

【摘要】目的:L-myc基因EcoRI多态性位于非编码区的第二内含子内,引起短型(S)和长(L)型两种基因型。研究结论不一,一般认为短型基因的携带者具有更高的肿瘤易感性和更差的预后。本研究的目的是探讨这一多态性在中国人群中与胃癌的关系。方法:90名胃癌患者和100名健康个体的资料被用于研究。多聚酶链反应(PCR)和EcoRI限制性内切酶反应被用于实验。结果:L-myc基因型的分布在肿瘤(LL26.7%;LS40.0%;SS33.3%)和正常人群(LL8.0%;LS68.0%;SS24.0%)中没有显著差异。L-myc短基因型与肿瘤淋巴结的转移相关(P<0.05),而与其它临床资料无关。这一多态性与胃癌的易感性也无关。结论:研究结果提示在中国胃癌患者中L-myc基因EcoRI多态性影响胃癌淋巴结转移的发展。

【关键词】L-myc限制性内切酶长度多态性胃癌

【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）35-0057-02

L-mycgeneEcoRIpolymorphismingastriccancerpatientswithinLiyangarea,Jinagsuprovience

【Abstract】Objective:TheL-mycEcoRIpolymorphismisanoncodingvariationinthesecondintronoftheL-mycgene,causingSandLalleles.InpidualscarryingtheSalleletendtohavepoorprognosisandhigherriskinseveralkindsoftumor,althoughcontroversialresultshavebeenreported.TheaimofthisstudywastoinvestigateifthispolymorphismisassociatedwithsusceptibilitytogastriccancerintheChinesepopulationandtoevaluatethepresenceofdifferenttypesofallelesingastriccancerpatientswithrespecttocancerhistology,stage,patients’ageandgender.Methods90gastricpatientsand100healthyunrelatedinpidualswerestudied.RestrictionfragmentlengthpolymorphismoftheL-mycgenewasexaminedbypolymerasechainreaction(PCR)followedbyEcoRIdigestion.ResultsTherewerenosignificantdifferencesingenotypedistributionbetweenthecontrolgroup(genotypes:LL8.0%;LS68.0%;SS24.0%)andthecancergroup(genotypes:LL26.7%;LS40.0%;SS33.3%).SignificantcorrelationbetweenS-allelepresenceandlymphnodalmetastasiswasfound(P<0.05).Nocorrelationwithotherclinicopathologicalfeatureswasobserved.NorelationbetweenL-mycpolymorphismandsusceptibilitytogastriccancerwasfound.ConclusionThisstudysuggeststhatL-mycgeneEcoRIpolymorphismaffectsthedevelopmentoflymphnodalmetastasesinChinesegastriccancerpatients.

【Keywords】L-mycpolymorphismgastriccancer

人L-myc基因位于1号染色体短臂3区2带(1p32),L-myc,c-myc和N-myc基因一起组成了myc基因家族。这些基因编码的转录因子参与调节了细胞增殖,凋亡,分化和肿瘤的发生和发展[1,8]。一个位于L-myc基因第二内含子内的T/G变异(gAATTC)产生了限制性内切酶EcoRI的识别位点。经EcoRI切割后,L-myc显示了2种等位基因的多态性,长型(L)和短型(S)。这一非编码的多态性是第一个被发现的与多种肿瘤病人预后有关的遗传变异[5]。关于这一多态性是否可以作为肿瘤预测的指标在肺癌,乳腺癌和胃癌等多种肿瘤中被研究过,但结果不一。一项Meta-分析综合了不同肿瘤的3563例病人标本和2953例对照并进行了分析,结果提示L-myc基因的短短表现型(S/S)与肿瘤淋巴结的转移和肿瘤危险性相关[10]。这一多态性与胃癌的关系仅仅在高加索[2,3]和日本[4,9]人群中研究过。本研究的目的是在中国人群中探讨L-myc基因EcoRI多态性与胃癌的关系。

对象与方法

1.研究对象：研究对象随机取材于2006-2010年诊断的90例胃癌患者(50男40女,年龄范围从33-79岁)。对照组为100例健康的体检志愿者(经一般血液常规,X光胸透和超生检查),年龄和性别与胃癌患者配对(表1)。

表1.L-myc基因EcoRI多态性在胃癌患者和对照中的分布

L-myc基因型(%)

例数长长型长短型短短型

对照组1008(8.0)68(68.0)24(24.0)

胃癌组9024(26.7)36(40)30(33.3)

数值为百分比

2.L-myc基因EcoRI长短型多态性的检测

用蛋白酶K法从外周血中提取基因组DNA。用多聚酶链反应(PCR)来扩增L-myc基因第二内含子EcoRI多态性两测的顺序。上游引物为:5’-ACGACCATTTGATAGGGAACTGGG-3’下游引物为5’-CCTTAATGGATCTCGGCCTCGGC-3’。PCR扩增产物长890bp。PCR反应体积为50μl,含模版DNA约50ng,引物浓度为10pmol,2mMMgCl2,200μM脱氧核糖核酸(dNTPs),和1国际单位的TaqDNA多聚酶(Invitrogen).DNA模版在94℃下变性5分钟,PCR循环参数为94℃变性1分钟,58℃引物退火1分钟,72℃延伸1分钟,共循环35次,最后一次循环后,扩增产物在72℃下再延伸7分钟以完成产物的延伸。PCR热循环仪产自Perkin-Elmer公司.(9600型)。取10μlPCR产物进行EcoRI(NewEnglandBiolab)限制性内切酶反应。反应体积为20μl,加入10国际单位的EcoRI内切酶,反应在37°C下作用2个小时。酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳和溴乙啶染色来检测L-myc基因长短型的多态性。

3.统计分析：用x2检验来分析L-myc基因表现型的变异在实验和对照组之间是否存在统计学的差异。实验组研究对象按临床病理特征被分类。用x2检验来分析这些病理特征是否与L-myc基因表现型相关。P<0.05认为具有统计学显著性差异。

结果

1.我们用多聚酶链反应(PCR)和EcoRI限制性内切酶反应来检测胃癌患者和健康对照组的L-myc基因EcoRI限制性片段长度多态性(RFLP),PCR产物经酶解后显示了2种长度:890bp(长型,L)和696bp(短,S),这2种长短表型给予3种L-myc基因表型(见图1)。

图1：3例PCR产物经EcoRI切割后，显示长长型(1,890bp)，短短型(3,696bp)和长短型(2,890+696bp)，M为DNA分子量标记。

2.L-myc基因的表型在胃癌组的分布为:长长型(LL)占26.7%;长短型(LS)占40.0%;短短型(SS)占33.3%。在对照组的分布为:长长型(LL)占8.0%;长短型(LS)占68.0%;短短型(SS)占24.0%。3种L-myc基因的表现型的分布在胃癌和对照组中没有显著差别(表2)。

3.根据一些临床病理特征,包括病人的年龄,性别,肿瘤分期和组织学特征等,胃癌患者被分类。L-myc基因的表现型被分为2类:“长短型+短短型”和”短短型”。L-myc基因的短型(S)表现型被发现与胃癌患者的淋巴结转移相关(P<0.05)。其它临床特征未发现与L-myc基因的表现型相关(表2)。

讨论

对肿瘤相关样本进行遗传学和免疫学指标的检测是一个揭示人群肿瘤易感性及肿瘤发生危险性的重要手段。L-myc基因EcoRI多态性在多种肿瘤和不同人群中被研究过[10]。这里我们首先在中国人群中对这一多态性与胃癌的关系进行了研究。

在胃癌患者和健康对照组中,L-myc基因EcoRI多态性的分布没有统计学差别。我们的结果提示短型等位基因的表型在中国人群中(尤其是在江苏溧阳地区)不是胃癌发生的危险因子。Dlugosz等对波兰人群进行了L-myc基因EcoRI多态性与胃癌关系的研究,得出了相似的结论[2]。而其它研究提示这一多态性在日本人群中与胃癌的遗传性预测有关[9]。我们的结果也证实短型等位基因的表型在胃癌中与淋巴节的转移有关。Mironov等在对俄罗斯人群的研究中并没有发现这一相关性[7],而Ishizaki等却发现了短型等位基因的表型与胃癌的转移相关[4]。Shibuta等发现了这一多态性与胃癌的易感性相关,但不能证实它与淋巴节的转移有关[9]。类似的研究产生不同的结果可由多种因素引起。例如环境因素,生活方式和种族的起源等。多种肿瘤的发生和发展与环境和遗传因素都相关。

L-myc基因的一个内含子的多态性影响了人胃癌发展进程的机制并不明确。可能的解释有:1,与L-myc基因在染色体上相邻的另一个基因在肿瘤转移中有直接的作用[5]。2,长型和短型的L-myc基因分别编码了在肿瘤淋巴结转移中功能不同的蛋白[5],但至今尚未有相关报道证实[9]。3,两种L-myc基因的转录调节区不同,而短短型的表达对肿瘤的转移有重要作用[5]。有研究报道L-myc蛋白调节细胞生长具有组织特异性。L-myc表达的变异参与了细胞恶性转化的调节。L-myc基因的不同成熟的信使RNA可翻译成结构各异的L-myc蛋白,因此L-myc癌基因本身也可能直接参与了转化的调节[6]。

我们提供了江苏省溧阳地区中国人群中L-myc基因EcoRI多态性与胃癌关系的研究资料。这一多态性在中国人群中是否可以作为某种预测的指标尚需要进一步的调查研究。

参考文献

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[3]Isbir,T.,I.Yaylim,S.Arikan,E.Kaytan,T.Karsidag,S.Bayrak,andH.Camlica.2002.ClosecorrelationbetweenrestrictionfragmentlengthpolymorphismofL-mycgeneandsusceptibilitytogastriccancer.CancerDetectPrev26:454-7.

[4]Ishizaki,K.,M.Kato,M.Ikenaga,K.Honda,K.Ozawa,andJ.Toguchida.1990.CorrelationofL-mycgenotypestometastasisofgastriccancerandbreastcancer.JNatlCancerInst82:238-9.

[5]Kawashima,K.,H.Shikama,K.Imoto,M.Izawa,T.Naruke,K.Okabayashi,andS.Nishimura.1988.ClosecorrelationbetweenrestrictionfragmentlengthpolymorphismoftheL-MYCgeneandmetastasisofhumanlungcancertothelymphnodesandotherorgans.ProcNatlAcadSciUSA85:2353-6.

[6]Kaye,F.,J.Battey,M.Nau,B.Brooks,E.Seifter,J.DeGreve,M.Birrer,E.Sausville,andJ.Minna.1988.StructureandexpressionofthehumanL-mycgenerevealacomplexpatternofalternativemRNAprocessing.MolCellBiol8:186-95.

[7]Mironov,N.M.,A.M.Aguelon,G.I.Potapova,O.V.Gorbunov,A.A.Klimenkov,andH.Yamasaki.1994.L-mycallelepolymorphismandprognosisformetastasesinRussiangastriccancerpatients.EurJCancer30A:1732.

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[10]Spinola,M.,P.Pedotti,T.A.Dragani,andE.Taioli.2004.Meta-analysissuggestsassociationofL-mycEcoRIpolymorphismwithcancerprognosis.ClinCancerRes10:4769-75.

基金项目：本文为江苏省科技厅指导性课题，课题编号：BS2004519