人神经母细胞瘤细胞中μ阿片受体piRNA-PIWI通路的调控作用研究

人神经母细胞瘤细胞中μ阿片受体piRNA-PIWI通路的调控作用研究

卫杰耿昌明韦道明孔晓东

（解放军第85医院神上海200052）

【摘要】目的：研究piRNA-PIWI通路在人神经细胞中的表达及其与μ阿片受体的作用关系。方法：采用Westernblot检测人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中PIWI蛋白各亚型的表达，分析24–33nt的小RNA文库，筛选与MILI和MIWI2相关的piRNA表达，构建siRNA转染细胞干扰μ阿片受体表达，检测其对piRNA-PIWI通路的影响。结果：人神经母细胞瘤细胞中存在piRNA-PIWI通路的表达，主要亚型为MILI和MIWI2，piRNA-PIWI通路受到μ阿片受体的调控。结论：piRNA-PIWI通路与μ阿片受体功能关系的阐明，为今后阿片受体的机制研究和piRNA的深入了解和应用提供了实验依据。

【关键词】人神经母细胞瘤细胞；piRNA-PIWI通路；μ阿片受体

【中图分类号】R73【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）02-0144-03

近年来，RNA的功能研究已成为生命科学领域最新的研究热点。2006年，在Nature和Science上同期发表了一类能够与PIWI蛋白相互作用的新型小分子非编码RNA，被命名为piRNA（PIWI-interactingRNA）[1-4]。与之前发现的miRNA/siRNA相比，piRNA的结构、生物发生途径、基因分布和功能存在显著不同，但目前仅发现piRNA在生殖相关事件和肿瘤的发生发展中起到了重要的调控作用，但对于其在中枢神经系统的作用机制尚未见研究报道。本研究旨在研究神经细胞中μ阿片受体对piRNA-PIWI通路的调控作用。

1.材料和方法

1.1细胞培养

人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）培养在含有10%胎牛血清、10mg/L青霉素和10mg/L氨苄青霉素的DMEM培养基（37℃，分数为5%CO2）。细胞融合度达到80%时使用0.25%胰蛋白酶进行消化和传代，培养周期约为6天。

1.2蛋白免疫印迹

SH-SY5Y细胞使用RIPA裂解液（含PMSF）裂解细胞，提取总蛋白后进行BCA蛋白定量，加入上样缓冲液，煮沸5min进行蛋白变性，转移蛋白进行SDS-PAGE电泳，电转PVDF膜220V1h，结束后使用5%milk-TBST封闭1h，加入PIWI家族的MILI，MIWI和MIWI2多克隆抗体，4℃过夜，次日回收一抗，使用TBST洗3次，5min/次，加入羊抗兔IgG抗体，室温反应1h后洗去二抗，加入显色液显色并拍摄。

1.3实时定量RT-PCR

使用Trizol试剂盒提取SH-SY5Y细胞的总RNA，然后进行反转录。反应条件：95℃预变性10min，然后95℃20s，55℃20s，72℃20s，40个循环，72℃延伸5min。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.4SiRNA的构建和转染

使用siRNA干扰μ阿片受体的表达，siRNA序列为ATTGATCCATTTTAGGTCAGG，委托生物科技公司合成，使用lipo2000进行转染。转染前4d将细胞传代至6孔板中，lipo2000脂质体介导的siRNA转染按照试剂说明书进行，在转染48h后使用westernblot检测μ阿片受体的蛋白表达。

1.5小RNA文库

MILI和MIWI2核糖核蛋白复合体进行免疫共沉淀，纯化得到MILI和MIWI2相关的小RNA，文库的构建和标注参照文献方法[5]。本实验中小RNA文库主要包括24–33nt的总RNA。

1.6数据统计

使用Prism5.0进行数据统计，数据以Mean±SD表示，不同分组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性意义。

2.结果

2.1人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中PIWI蛋白家族表达

Westernblot的检测结果显示，在SH-SY5Y细胞中存在PIWI蛋白家族的MILI和MIWI2亚型表达，而未检测到MIWI亚型的表达，见图1。

图1.SH-SY5Y细胞中MILI、MIWI和MIWI2的蛋白表达

2.2人神经母细胞瘤细胞中MILI和MIWI2结合的piRNA表达

MILI结合的piRNA主要为-26nt，MIWI2结合的piRNA为-28nt。克隆24–33nt的总RNAs，对免疫共沉淀得到的MILI和MIWI2相关的每个文库进行测序，发现每个文库中通常有40%-70%的小RNA序列与人类基因组序列完全符合，MILI和MIWI2相关的piRNA呈正态分布，峰值分别为26和28nt（见图2）。

图2.piRNA文库中符合LINE1逆转录转座子共有序列的piRNA数量，

LINE1的5’端含有多个200bp的重复单元。

2.3μ阿片受体对MILI和MIWI2的调控

SH-SY5Y细胞转染表达siRNA并携带绿色荧光蛋白的GFP质粒，在转染后48h表达GFP的阳性细胞明显增多，荧光强度增强，与此一致的是，westernblot检测证实μ阿片受体表达显著下降，证明转染成功（见图3A，3B）。在μ阿片受体表达干扰的细胞中，westernblot的检测MILI和MIWI2的表达，结果显示，在干扰μ阿片受体后，MILI和MIWI2的表达出现显著下调（见图3C）。

A

2.4图3.μ阿片受体对MILI和MIWI2的调控。（A）转染GFP质粒的细胞荧光照片；（B）siRNA干扰μ阿片受体表达；（C）μ阿片受体表达下调后MILI和MIWI2的表达。

2.5μ阿片受体对piRNA表达谱的调控

在μ阿片受体表达干扰的细胞中，基因组注释显示干扰μ阿片受体表达后，MILI结合的piRNA数量增加，MIWI2结合的piRNA数量显著减少，证实μ阿片受体在piRNA的合成中起到了重要的调控作用。并且可能是通过调控MILI和MIWI2的表达来实现这一调控作用。

图4.MILI和MIWI2相关的piRNA免疫共沉淀。

3.讨论

从piRNA的发现到现在的功能学研究，使得piRNA的生物生成和功能得到了初步认识，但目前仍有许多关键性问题需要进一步探索。本研究发现，在中枢神经系统中存piRNA-PIWI通路的表达，并且μ阿片受体对piRNA-PIWI通路具有重要的调控作用。

已有研究报道，piRNA-PIWI通路参与维持干细胞功能和基因组稳定性[5]。在大鼠胚胎的发育过程中，精子细胞中的PIWI蛋白和piRNA能够通过调控转录，翻译或者支持染色体同源性检索以及染色体配对，从而在减数分裂和分裂后事件中发挥潜在的调控作用，因此可见PIWI蛋白在生物起源中具有重要的研究价值[6]。更重要的是，piRNA是通过与PIWI蛋白的结合而发挥作用，因此研究者对piRNA的潜在调控网络进行了研究，已发现参与piRNA-PIWI通路调控的基因有Arm、Yb、Zucc、Cuff、Squ、Rhino等等，反映出piRNA-PIWI通路在生物体内的重要性[7，8]。我们的研究第一次在人神经细胞中检测到了PIWI蛋白亚型MILI和MIWI2的存在，证实了piRNA-PIWI通路不仅在胚胎干细胞和肿瘤细胞中存在表达，同时在神经系统也存在独特的作用。

内源性阿片肽与阿片受体是神经科学领域的研究热点之一，阿片受体属于G蛋白偶联受体家族成员，中枢神经系统中主要存在μ、κ、δ、σ四种亚型。研究证实μ受体的C端在阿片受体激活后的信号转导及依赖和耐受中发挥着重要作用。因此，近年来研究者以阿片C端为蛋白靶点，通过筛选cDNA文库得到了与阿片受体结合的蛋白，如蛋白激酶C（PKC）、丝蛋白A（FilaminA）、磷脂酶D2（PLD2）等，同时在后续的研究也证实，多种蛋白参与或者影响阿片受体的功能[9-11]。本研究中发现，在μ受体干扰的神经细胞中，MILI和MIWI2的蛋白表达下调，证实其受到μ受体的调控，而且与MILI和MIWI2结合的piRNA表达也随μ受体的表达下降而发生改变，从而证实piRNA-PIWI通路的功能受到μ受体的调控。

本实验结果证实piRNA-PIWI通路在神经母细胞瘤细胞中存在表达，其主要蛋白亚型为MILI和MIWI2，μ受体下调能够抑制MILI和MIWI2的表达，影响piRNA表达谱，这为今后piRNA的深入研究和应用提供了实验依据。

【参考文献】

[1]GirardA,SachidanandamR,HannonGJ,etal.AgermlinespecificclassofsmallRNAsbindsmammalianPiwiproteins.Nature,2006,442(7099):199-202.

[2]AravinA,GaidatzisD,PfefferS,etal.AnovelclassofsmallRNAsbindtoMILIproteininmousetestis.Nature,2006,442(7099):203-7.

[3]GrivnaST,BeyretE,WangZ,etal.AnovelclassofsmallRNAsinmousespermatogeniccells.GenesDev,2006,20(13):1709-14.

[4]LauNC,SetoAG,KimJ,etal.CharacterizationofthepiRNAcomplexfromrattestes.Science,2006,313(5785):363-7.

[5]Aravin,A.A.,Sachidanandam,R.,Girard,A.,Fejes-Toth,K.,andHannon,G.J.(2007b).DevelopmentallyregulatedpiRNAclustersimplicateMILIintransposoncontrol.Science316,744-747.

[6]YinH,LinH.AnepigeneticactivationroleofPiwiandaPiwi-associatedpiRNAinDrosophilamelanogaster.Nature,2007,10(1038):1-5.

[7]BrenneckeJ,AravinAA,StarkA,etal.DiscretesmallRNAgeneratinglociasmasterregulatorsoftransposonactivityinDrosophila.Cell,2007,128(6):1089-103.

[8]AravinAA,SachidanandamR,Bourc’hisD,etal.ApiRNApathwayprimedbyinpidualtransposonsislinkedtodenovoDNAmethylationinmice.MolCell,2008,31(6):785-99.

[9]OnoprishviliI,AndriaML,KramerHK,etal.InteractionbetweentheμopioidreceptorandfilaminAisinvolvedinreceptorregulationandtrafficking.MolecularPharmacology.2003,64(5):1092-100.

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[11]GuangW,WangH,SuT,etal.RoleofmPKCI,anovelμ-opioidreceptorinteractiveprotein,inreceptordesensitization,phosphorylation,andmorphine-inducedanalgesia.MolPhannacol.2004,66(5):1285-92.