MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中的表达及意义

MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中的表达及意义

姜国栋滕俊策王忠芬王志武

姜国栋滕俊策王忠芬王志武（招远市人民医院胸外科云南招远265400）

【中图分类号】R742【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)19-0133-05

【摘要】目的检测非小细胞肺癌(NSCLC)中基质金属蛋白酶9（MMP-9）及金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）的表达情况，探讨MMP-9及TIMP-1的表达水平与非小细胞肺癌的组织学分型，细胞分级，淋巴结转移，临床病理分期的关系及临床意义。方法采用免疫组织化学SP法对非小细胞肺癌患者，随机选取肿瘤原发灶蜡块保存良好及随访资料完整的病例43例及15例正常肺组织切片进行免疫组织化学染色，监测MMP-9及TIMP-1的表达水平，并分析非小细胞肺癌中MMMP-9及TIMP-1的表达水平与非小细胞肺癌的组织学分型，细胞分级，淋巴结转移，临床病理分期及患者预后的关系。结果MMP-9和TIMP-1在正常肺组织中均有表达，表达部位主要在肺间质，表达强度较弱；MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中的表达主要位于癌细胞和癌旁间质细胞，均在胞浆内表达，癌细胞表达较强，间质细胞表达较弱；非小细胞肺癌组织中MMP-9和TIMP-1的阳性表达率均显著高于癌旁正常肺组织（P<0.05）。MMP-9和TIMP-1的表达与肿块大小及部位无关（P>0.05）；MMP-9在腺癌中的阳性表达率高于鳞癌（P<0.05），TIMP-1在腺癌和鳞癌中的阳性表达率差异无显著性(P>0.05)，MMP-9的阳性表达率随组织分化程度的增加而有降低趋势，TIMP-1的阳性表达率随组织分化程度的增加而有增强趋势。MMP-9的阳性表达率随P-TNM分期增高而增加，TIMP-I阳性表达率随P-TNM分期增高而降低；有淋巴结转移者MMP-9和TIMP-1的阳性表达率高于无淋巴结转移者(P<0.05)；MMP-9的阳性表达率与患者3年生存期呈负相关(P<0.05)，TIMP-9的阳性表达率与患者3年生存期呈正相关(P>0.05)。

【关键词】非小细胞肺癌基质金属蛋白酶9基质金属蛋白酶抑制剂1免疫组织化学

有研究表明MMP-9及其抑制剂TIMP-1的表达异常与人恶性肿瘤的浸润与转移密切相关。肺癌发病率和死亡率50年来不断上升，已成为增长最快的一种恶性肿瘤，严重威胁着人类健康与生命，本研究旨在用免疫组织化学方法检测和分析原发性非小细胞肺癌中MMP-9和其抑制剂TIMP-1的表达情况，并探讨其与肺癌病理分型、临床分期和淋巴结转移临床资料的关系，为进一步应用以MMP为靶点的抗肿瘤治疗提供理论依据

1材料和方法

1.1标本来源及处理

标本选自本院2001年1月至2008年12月手术切除后经病理病理的NSCLC标本43例（追观资料完整）及本院2001年7月至2008年5月正常支气管上皮组织15例（成人非肺癌解剖组织）。43例NSCLC患者中，男性35例，女性8例，男女之比4.37:1；年龄24-68岁；肿块直径>3cm25例，≤3cm18例；中央型肺癌20例，周围型肺癌23例。所有标本均经10%的福尔马林液固定，常规石蜡包埋连续切片，厚4μm，分别作HE染色和免疫组织化学染色。

所有组织蜡块重新切片、HE染色、阅片。43例NSCLC中鳞癌21例，腺癌22例，高分化癌（gradel，G1）7例，中分癌22例（grade2，G2）、低分化癌症14例（grade3，G3）。

I期11例，II期21例，III期限11例。按淋巴结转移发生与否分组，有淋巴结转移11例，无淋巴结转移32例。所有43例患者均有完整的随访资料。患者术前均未进行化学治疗及放疗。

1.2实验方法

免疫组织化学S-P法：（1）石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精至水化，蒸馏水浸泡5分种。（2）室温下3％H2O2作用10分钟，阻断内源性过氧化酶的活性。（3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。(4)用于检测抗原的切片经0.01M枸橼酸钠抗原抗原修复液修复15分钟。(5)PBS洗2×5分钟。(6)滴加5％山羊血清室温下孵育15分钟。(8)除去血清，不洗，滴加一抗温盒内4℃冰箱过夜，PBS液洗3×5分钟。(9)滴加二抗，室温下孵育30分钟，PBS液洗3×5分钟。(10)滴加三抗，室温下孵育30分钟，PBS液洗3×5分钟。(11)滴加DAB显色，显微镜下观察至显色较好时，置于自来水终止显色。(12)流水充分冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，甘油明胶封片，镜下观察。

对照：用已知阳性的乳腺癌组织切片作阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3结果判断

阳性染色为棕黄色颗粒，MMP-9和TIMP-1的阳性信号均以细胞浆出现棕黄色颗粒。阳性结果判断：随机观察10个高倍视野，计算细胞数：阳性细胞数≤10％为阴性染色，10％～30％为阳性（＋），30％～50％为阳性（＋＋），50％～70％为强阳性（＋＋＋）。

1.4统计学处理

采用χ2检验，以P<0.05确定差异有显著意义。

2结果

2.1MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌与正常肺组织表达的比较

MMP-9及TIMP-1的阳性染色均呈棕黄色颗粒，在正常肺组织中均有表达，表达部位主要在肺间质，表达强度较弱，染色较浅。（见图1，图2）MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中的表达主要位于癌细胞和癌旁间质细胞，均在胞浆内表达，癌细胞表达较强，而间质细胞表达较弱。（见图3-6）。非小细胞肺癌中MMP-9及TIMP-1的阳性表达率分别为74.4％（32/43例）、55.8％（24/43例），明显高于正常肺组织的26.7％（4/15例）、20.0％（3/15例），经统计学检验有显著意义（P<0.05）。（详见表1、2）

表1MMP-9在非小细胞肺癌与正常肺组织表达的比较

组织例数阳性数阳性率（％）P值

正常组织15426.7P<0.05

肺癌组织433274.4

表2TIMP-1在非小细胞肺癌与正常肺组织表达的比较

组织例数阳性数阳性率（％）P值

正常组织15320.0P<0.05

肺癌组织432455.8

2.2MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中表达与患者病理类型的关系

MMP-9和TIMP-1在鳞癌中的阳性表达率分别为57.1％（12/21例）和52.4％（11/21例），在腺癌中的阳性表达率分别为90.9％（20/22例）和59.1％（13/22例），MMP-9在腺癌和鳞癌中的阳性表达率差异有显著性（P<0.05），TIMP-1在腺癌和鳞癌中的阳性表达率差异无显著性（P>0.05）。（详见表3）

表3MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中表达与肿瘤病理类型关系的比较

病理类型例数MMP-9TIMP-1

阳性数阳性率（％）P值阳性数阳性率（％）P值

鳞癌211257.1P<0.051152.4P>0.05

腺癌222090.91359.1

2.3MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中表达与肿瘤的大小与部位的关系

MMP-9和TIMP-1在肿瘤直径小于或等于3厘米的非小细胞肺癌中阳性表达率分别为66.7％（12/18例）和50.0％（9/18例），在肿瘤直径大于3厘米的非小细胞肺癌中阳性表达率分别为80.0％（20/25例）和60.0％（15/25例）。MMP-9和TIMP-1在肿瘤直径小于或等于3厘米的非小细胞肺癌中与大于3厘米的非小细胞肺癌中阳性表达率差异无显著性（P>0.05）。中央型非小细胞肺癌中MMP-9和TIMP-1的阳性表达率分别为63.8％（13/20例）和50.0％（10/20例），周围型非小细胞肺癌中MMP-9和TIMP-1的阳性表达率分别为82.6％（19/23例）和60.9％（14/23例），MMP-9和TIMP-1的阳性表达率与肿瘤的部位无差异显著性（P>0.05）。

2.4MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中表达与肿瘤的分化程度的关系

MMP-9及TIMP-1在高分化组（G1期）的阳性表达率分别为42.9％（3/7例）和85.7％（6/7例）；在中分化组（G2期）的阳性表达率分别为77。3％（17/22例）和59.1％（13/22例）；在低分化组（G3期）的阳性表达率分别为85.7％（12/14例）和35.7％（5/14例）。非小细胞肺癌中MMP-9及TIMP-1的表达随病理组织学级别增加，MMP-9阳性表达逐渐增强，而TIMP-1阳性表达逐渐减弱，且高分化组与低分化组MMP-9的阳性表达率差异有显著性（P<0.05）。（详见表4）

表4MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中表达与肿瘤分化程度的关系比较

分化程度例数MMP-9TIMP-1

阳性数阳性率（％）P值阳性数阳性率（％）P值

高分化7342.9P>0.05①685.7P>0.05①

中分化221777.3P>0.05②1359.1P>0.05②

低分化141285.7P<0.05③535.7P<0.05③

注：①高分化与中分化比较②中分化与低分化比较③高分化与低分化比较

2.5MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中表达与临床分期的关系：

MMP-9和TIMP-1在非小细胞肺癌中的临床分期的阳性表达率分别为Ⅰ期45.5％（5/11例）、81.8％（9/11例），Ⅱ期85.7％（18/21例）、52.4（11/21例）。Ⅲ期100％（11/11例）、36.4（4/11例），MMP-9和TIMP-1在非小细胞肺癌中阳性表达率与临床分期有相关性，随临床分期的增高MMP-9的阳性表达增强，TIMP-1的阳性表达减弱，与Ⅰ期相比，Ⅲ期中的MMP-9、TIMP-1表达差异有显著性（P<0.05）。（详见表5）。

表5MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中表达与患者临床分期的关系

临床分期例数MMP-9TIMP-1

阳性数阳性率（％）P值阳性数阳性率（％）P值

Ⅰ11545.5P>0.05①981.8P>0.05①

Ⅱ211885.7P>0.05②1152.4P>0.05②

Ⅲ1111100.0P<0.05③436.4P<0.05③

①Ⅰ与Ⅱ比较②Ⅱ与Ⅲ比较③Ⅰ与Ⅲ比较

2.6MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中表达与淋巴结转移的关系

MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中有淋巴结转移组的阳性表达率分别为100％（11/11例）、65.6％（21/32例），在无淋巴结转移组的阳性表达率分别为65.6％（21/32例）、27.3％（3/11例）MMP-9及TIMP-1在有淋巴结转移组与无淋巴结转移组的阳性表达率差异有显著性（P<0.05）。（详见表6）。

表6MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中表达与淋巴结转移关系的比较

淋巴结转移例数MMP-9TIMP-1

阳性数阳性率（％）P值阳性数阳性率（％）P值

无322165.6P<0.052165.6P<0.05

有1111100327.3

2.7MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中表达与患者预后的关系

可随访的43例患者中，术后生存期小于3年者24例，MMP-9、TIMP-1的阳性表达率分别为87.5％（21/24例）、70.8％（14/24例），术后生存期大于或等于3年者19例，MMP-9、TIMP-1的阳性表达率分别为57.9％（11/19例）、36.8％（7/19例）。两组差异有统计学意义。（详见表7）。

表7MMP-9及TIMP-1在非小细胞肺癌中表达与患者术后生存期关系的比较

术后生存期例数MMP-9TIMP-1

阳性数阳性率（％）P值阳性数阳性率（％）P值

<3年242187.5P<0.051470.8P<0.05

≥3年191157.9736.8

3讨论

恶性肿瘤的侵袭转移是一个极其复杂的多步骤多阶段发展过程，涉及肿瘤细胞与宿主细胞间一系列相互作用，并受多种基因及其产物的影响。与其它恶性肿瘤一样，非小细胞肺癌局部侵袭转移的机理目前尚未十分明了，但已知是一个由一系列步骤组成的复杂过程。我们采用免疫组织化学的方法对近年来临床工作中的非小细胞肺癌病例，取经病理证实的标本，结合临床及随访资料对MMP-9和TIMP-1的表达与非小细胞肺癌临床病理特征及预后的关系的做一些初步的研究。

3.1MMP-9和TIMP-1在非小细胞肺癌患者中的表达与病理类型及组织分级的关系

由于我们选取的样本较小，且大细胞肺癌的发病率降低，所以本组研究中不包括大细胞肺癌的病例，主要对非小细胞肺癌进行研究，大量的研究发现MMP-9和TIMP-1在肺癌组织中主要存在于癌细胞胞浆中，成纤维细胞及内皮细胞胞浆中亦有表达[1，2]。Grignon[3]等研究认为，肿瘤组织中的TIMPS表达与MMPS一样比正常高，并与肿瘤的恶性程度、预后相一致，我们所研究的非小细胞肺癌中TIMP-1表达率也较正常肺组织高，可能与TIMP-1还具有明显的生长因子活性，能刺激多种细胞生长（包括肿瘤细胞）有关，另外TIMP-1在对增高的MMP-9局部反应的同时，也通过与活化的MMP-2、MMP-3、MMP-8结合来抑制三者的作用，癌变时此三者表达的增加也可能引起TIMP-1的增高。部分肺癌组织TIMP-1mRNA呈阳性而TIMP-1蛋白却呈阴性表达，这一结果表明，并非所有TIMP-1表达阴性者均为该基因缺失，有可能是由于TIMP-1的表达受转录后的机制调节所致[4]。本实验研究表明：在非小细胞肺组织中MMP-9和TIMP-1的阳性表达率分别是74.4％（32/43例）、55.8％（24/43例），明显高于正常肺组织的26.7％（4/15例）、20.0％（3/15例）（P<0.05），与上述学者研究结果相一致。我们对非小细胞肺癌的研究表明MMP-9在腺癌中的阳性表达率高于鳞癌（P<0.05）TIMP-1在腺癌和鳞癌中的阳性表达率差异无显著性（P>0.05），这也许能说明临床上肺腺癌往往较鳞癌预后差，且腺癌易早期转移的特性。Kodate等研究发现超过65％的腺癌比例MMP-9表达阳性，在分化程度差的腺癌中MMP-9的阳性表达率较分化程度高的病例高，MMP-9的阳性病例的预后也明显较MMP-9的阴性病例的预后差，本实验研究也发现，MMMP-9及TIMP-1的表达随病理组织学级别增加，MMP-9阳性表达逐渐增强，而TIMP-1阳性表达逐渐减弱，且高分化组与低分化组MMP-9的阳性表达率差异有显著性（P<0.05）。肺癌组织中TIMP-1随着MMP-9表达增高而上调的机制还不清楚。

3.2MMP-9和TIMP-1在非小细胞肺癌患者中的表达与P-TNM分期、肿瘤大小及淋巴结的关系

有关MMP-9和TIMP-1在非小细胞肺癌患者中的表达与P-TNM分期、肿瘤大小及淋巴结的关系，目前结果并不一致。Nawrocki等[5]研究结果表明，MMPS的表达强度及其mRNA的水平随着肿瘤的异型性、失分化程度及TNM分级的增加而升高，其中MMP-9与肿瘤的P-TNM分期显著相关，TIMP-1在肿瘤中的表达强度也显著高于正常肺组织。也有研究结果显示MMP-9的表达与淋巴结转移呈正相关，而TIMP-1的表达与淋巴结转移呈负相关。本实验研究结果为MMP-9阳性表达率随着肿瘤P-TNM分期进展而有增加趋势，TIMP-1阳性表达率随着肿瘤P-TNM分期进展而有增降低趋势，与Ⅰ期相比，Ⅲ期中的MMP-9、TIMP-1表达差异有显著性（P<0.05）。这表明P-TNM分期高的肿瘤产生的MMP-9相对增多，TIMP-1相对减少，肿瘤的侵袭和转移能力也随之增强。推出MMP-9和TIMP-1在肺癌的演进过程中起关键作用，并与肿瘤恶性程度有密切关系。研究还发现，MMP-9、TIMP-1的阳性表达率与肿瘤大小的进展无关（P>0.05）；有淋巴结转移组的MMP-9阳性表达率明显高于无淋巴结转移组（P<0.05），有淋巴结转移组的TIMP-1阳性表达率明显低于无淋巴结转移组（P<0.05），这表明MMP-9的高表达和TIMP-1的低表达可能促进非小细胞肺癌的淋巴结转移，这与有的文献报道并不完全一致，具体机制有待于进一步研究。

3.3MMP-9和TIMP-1在非小细胞肺癌患者中的表达与患者预后的关系

由于肿瘤的侵袭及转移能力与肿瘤的复发及预后密切相关，而MMP-9和TIMP-1的表达水平明显影响肿瘤的侵袭和转移能力，进一步影响肿瘤的复发。因而肿瘤组织MMP-9和TIMP-1的表达可能与肿瘤的预后存在一定的关系。KaramerisA[6]，FongKM[7]等人研究均证明MMP-9、TIMP-1与肺癌的浸润、转移预后相关。MMP-9高表达者易发生转移，预后差；TIMP-1高表达者不易发生转移预后好。MMPS、TIMPS可以作为判断肺癌预后的指标。MMPS表达越强的肺癌预后越差，TIMPS表达越强的肺癌预后相对较好。分析本实验结果，可随访的43例患者中，术后生存期小于3年者24例，MMP-9的阳性表达率分别为87.5％（21/24例），术后生存期大于或等于3年者19例，MMP-9、的阳性表达率分别为57.9％（11/19例）、两组差异有统计学意义。肿瘤患者的预后与多种因素有关，包括患者的年龄、性别、体质以及肿瘤的部位、大小、组织学类型、侵袭范围、转移情况、治疗时机和措施等。其中侵袭范围和和转移情况是我们判断预后的最常考虑的两个因素，侵袭范围越大，意味手术切除的范围越大，当被侵袭组织器官自我功能代偿能力有限时，病人术后或癌症晚期相应器官功能首先所带来的并发症越严重。影响癌症患者预后的另一个重要因素是肿瘤的转移情况，包括淋巴结转移和血行转移。淋巴结转移体现在引流淋巴结的肿大和恶性生长，血行转移体现在通过血管实现的机体转移灶。MMP-9对细胞外基质及基底膜的降解为肿瘤的侵袭和转移提供了条件，另外细胞外基质成分的降解产物（如胶原、蛋白多糖）对癌细胞有化学趋向性，再加上MMP-9诱导肿瘤细胞分泌碱性成纤维生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）、E钙粘附素、血管内皮生长因子，进一步促进肿瘤血管的形成，也为肿瘤的转移创造了条件。MMP-9正是通过这些机制促进了肿瘤转移，影响患者的预后。综上所述：检测肺癌组织中MMP-9、TIMP-1可作为判断肺癌恶性程度转移及预后的指标。

3.4MMP-9和TIMP-1的表达在非小细胞肺癌患者中的意义展望

对术后肿瘤标本的病理诊断中，MMP-9与TIMP-1的表达水平可作为判断非小细胞肺癌患者预后的指标，结合患者的年龄、性别、体质以及肿瘤的部位、大小、侵袭范围、转移情况做出的预后判断，比单纯依靠某一或几个指标所做的判断，将更准确可靠。分子生物学的进展加深了我们对肿瘤生物学特性得了解，近而使我们对肿瘤的诊治有了新的思路，这些新的思路主要包括[7]：（1）从基因的异常诊断癌症；（2）从分子生物学的的新发现来决定放化疗方案；（3）基因治疗；（4）开发新的化疗药物。

附图表

图1MMP-9在正常肺组织中的低表达400×

图2TIMP-1在正常肺组织中的低表达400×

图3MMP-9在非小细胞肺癌（腺癌）组织中的表达400×

图4MMP-9在非小细胞肺癌（鳞癌）组织中的低表达400×

图5TIMP-1在非小细胞肺癌（腺癌）组织中的表达400×

图6TIMP-1在非小细胞肺癌（鳞癌）组织中的表达400×

参考文献

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[7]FongKM，KidaY，ZimemermanPV，etal.TIMP-1andadverseprognosisinnon-smallcelllungcancer[J].ClinCancerRes，1996；2(8):1369-72.