肺炎支原体感染的实验室诊断方法及进展

肺炎支原体感染的实验室诊断方法及进展

王好玉1管乐东2陶爱军3

1山东省青州市人民医院262500；2潍坊市寒亭区人民医院261100；3寿光市中医医院262700

目前从人体分离到的支原体总数已达20多种，对人致病的主要有肺炎支原体、解脲脲原体、人型支原体和生殖道支原体。肺炎支原体是非典型肺炎和社区获得性肺炎的常见病原体之一，它通过口、鼻分泌物经空气传播，可引起儿童气管炎、支气管炎、原发性非典型肺炎和成年人社区获得性肺炎等呼吸道疾病。支原体肺炎的发病率可占所有肺炎总发病率的20%-30%，在流行高峰时其发病率甚至可达到肺炎总发病率的70%-80%。肺炎支原体易感人群主要是儿童和青少年（尤其是5-19岁）。

临床表现除呼吸道感染外，尚可引起多种肺外症状，可以与其它细菌、病毒感染混淆，并且对B一内酞胺类无反应，也有关于混合感染的报道，在儿童尤其是5岁以下的儿童呼吸道感染中扮演着极为重要的角色。肺炎支原体感染可以无特殊的临床表现，实验室指标及影像学表现，目前也没有快速有效的特异性诊断方法免疫应答反应主要基于微生物表面的肤和糖脂抗原，其中，Ig-M抗体多在一周左右开始升高，随后是Ig-G抗体，再感染时Ig-G和Ig-M滴度升高，由于时间的延迟和二次血清的不易获得，抗体检测临床意义略差。因此，及时快速准确的实验室诊断显得尤为重要，随着分子生物学技术在支原体研究领域的应用，PCR技术己经成为快速诊断支原体感染的方法，目前已发展了聚合酶链反应和基因探针等分子生物学检测方法，并有较多文章对各种分子生物学方法及血清学方法进行比较，其中荧光实时定量PCR因费时少并能全程监控而较其它方法先进，本文就近年来国内外有关文献中介绍的某些检测方法做一综述。

1、病原学检查培养法：

为检测活的支原体的方法，支原体可在有氧和无氧条件下均能生长，生长速度慢，一般为7-10天，作为传统的检测手段，至今仍是支原体鉴定的金标准，由于可靠性好，但因耗时长，儿童难治性肺炎支原体肺炎的临床研究时长，作出判定需3-4周，对临床指导治疗意义不大，且培养难度大，阳性率不高，容易漏诊，故临床少用，而韩雪梅等[15]采用Mp快速液体培养法，利用MP生长代谢产物使培养液体中指示剂颜色发生改变来判断MP生长，该培养法于24h内即可发出报告，阳性率可达36.0%，说明早期做MP液体培养对诊断肺炎支原体感染有重要参考价值，但是如果标本中含有大量能分解尿素的细菌如大肠埃希菌、假单胞菌、革兰阳性球菌时，可能对支原体培养基有影响，导致假阳性。超高倍显微诊断：取咽拭子标本处理后涂予玻片，置于万倍光显微镜下观察上皮细胞内活的支原体，费时短，但对仪器要求高，对操作者的临床经验和临床知识要求高，且不能确定病原体的具体名称。由于培养的困难，血清学可观的阳性率，以及可能存在的暂时无症状的携带者的原因，使支原体感染的诊断变的很困难。

2、抗原检测：呼吸道标本MP直接抗原快速检测方法包括：直接免疫荧光、对流免疫电泳、免疫印迹和抗原捕获EIA由于这些方法敏感性较低与呼吸道存在的其他支原体存在交叉反应，使其应用受到限制，由于抗原的检测试验受到检测敏感性的限制，当存在较好的核酸扩增技术时，不推荐其用于诊断目的，国内市场也没有检测MP抗原的检测试剂，最近，很多新的技术发展起来用于支原体的诊断，分子生物学领域最为明显，自1980年以来，通过实验室和临床研究，确定了PCR方法检测MP感染的可靠性，PCR法成为当前检测病原的常见方法，?其中，一些与PCR相关的技术提供了更好的敏感性及更加的快速和简捷，在这些方法中有实时PCR，巢式PCR，RT一PCR和多重PCR，但PCR的实验条件要求非常严格，且极微量的污染都会造成非特异性扩增。

3、间接检测：支原体感染人体后，一般在经过7-10天后免疫力正常的人体会对其产生抗体，对其进行检测能间接证明存在支原体感染，血清学检测是诊断肺炎支原体感染的主要方法，常见的有免疫荧光试验，血清补体结合试验，颗粒凝集实验印和酶联免疫吸附试验等，补体结合试验试验有省时，简便和经济的特点，单次滴度为64为阳性，提示近期感染，是最早应用MP实验室常规诊断的试验方法，现已被改良的方法广泛替代，在不同的试验中靶抗原不同，有的是蛋白，有的是糖脂类成分，尚未证实这些抗体检测试验系统是否与生殖支原体存在交叉反应，一些商品化试剂盒用CF方法作为评价参考，但考虑到CF方法可检测到与其他微生物或组织有交叉反应的非特异糖脂抗原，其检测结果的质量受到限制（出现假阳性），不适于作为Mp感染诊断的参考标准，敏感性和特异性尚不理想，代谢抑制试验根据特异性抗体能阻止支原体生长及代谢这一特性，对MP采用发酵抑制试验进行血清抗体测定，MP的代谢抑制试验需3-5d才能完成，一般在症状出现后2周左右出现代谢抑制抗体，持续时间长，适用于作血清流行病学调查，敏感性与间接性血凝及补体结合试验相等或稍高，间接免疫荧光试验荧光素能和抗体蛋白子结合而不使抗体活性丧失，仍能与相应的抗原结合形成免疫复合物，此复合物由于荧光素的参与，在荧光显微镜下能观察到其存在，从而能检测相应的抗原，间接血凝实验：由吸附于玻片上的抗原组成，特异抗体通过与抗人IgM或IgG荧光染料结合染色而被检测，这些试剂盒提供了精确、定量的血清学资料，但试验结果的判断受人的主观影响，并需使用荧光显微镜。

参考文献：

[1]黄海辉，张婴元，汪复，等.亚洲地区肺炎支原体和肺炎衣原体在成人社区获得性肺炎中的流行病学调查[J].中国感染与化疗杂志，2008，8（2）：89-93.

[2]CaoB，RenLL，ZhaoF，eta1.ViralandMycoplasmapneumoniaecommunity-acquiredpneumoniaandnovelclinicaloutcomeevaluationinambulatoryadultpatientsinChina[J].EurJClinMicrobiolInfectDis，2010，29（11）：1443-1448.

[3]KicinskiP，Wisniewska-LigierM，Wozniakowska-GesickaT.PneumoniacausedbyMycoplasmapneumoniaeandChlamydophilapneumoniaeinchildren-comparativeanalysisofclinicalpicture[J]AdvMedSci.2011，56（1）：56-63.

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