宁脑汤对大鼠脑出血急性期保护作用及对NSE的影响

宁脑汤对大鼠脑出血急性期保护作用及对NSE的影响

沙拉·胡吉肯刘远新

沙拉·胡吉肯刘远新（新疆医科大学附属中医医院新疆乌鲁木齐830000）

【摘要】目的通过实验性大鼠脑出血模型研究宁脑汤对脑出血后神经组织的保护作用及其机制。方法采用自体动脉血注入法建立实验性脑出血动物模型。将大鼠随机分为假手术组，模型+蒸馏水组（空白对照组），模型+宁脑汤组（宁脑汤组），模型+甘露醇、速尿组（西药组），模型+宁脑汤+甘露醇、速尿组（中西医结合组）。观察神经缺损症状的变化及检测血清NSE含量。结果模型组大鼠偏瘫状态明显，脑组织出现水肿，说明自体动脉血注入法建立的大鼠脑出血模型成功。中西医结合组能明显改善实验大鼠的偏瘫状态（P<0.01）及降低NSE含量（P<0.01）。结论宁脑汤对脑出血模型上述指标具有明显的改善,具有神经保护作用。中西医结合组可明显减轻急性期组织损伤,减轻脑水肿,改善预后.既能弥补中药起效缓慢的缺点,又能纠正西药维持时间短的弱点,且对脏器的毒性损害可因西药用量减少而下降。

【关键词】宁脑汤脑出血神经元特异性烯醇化酶（NSE）神经功能缺损

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）36-0022-02

脑出血（ICH）急性期药物治疗是迄今神经病学领域研究热点之一。ICH后病理生理变化复杂，众多因素参与了这一病理过程，ICH后血肿周围脑组织血流量下降可引起脑水肿[1]，血流恢复引发了再灌注损伤，又进一步加重脑水肿。目前，临床上主要应用脱水药物减轻脑水肿，预防脑疝的发生，挽救患者的生命，尚缺乏有效的手段治疗脑水肿导致的神经功能缺损。实验表明，出血性脑损伤不仅由于血肿的占位效应及血肿对周围组织的直接破坏，继发性损伤也是出血性脑损伤的重要原因。脑水肿是脑损伤严重性的一个标志。本实验通过观察宁脑汤对大鼠ICH急性期神经缺损功能改善及相关指标的影响，客观地验证其有效性。NSE目前被认为是神经元损害的特异性指标，其血清中的水平可代表神经元损害的程度，可作为脑保护作用药物疗效的评价指标，并对其治疗的量效关系和治疗时机进行初步探讨，为宁脑汤临床应用提供理论依据。

1.材料

1.1动物

健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，鼠龄8-10周，体重280±20g，雌雄各半由新疆医科大学动物实验中心提供，饲养期间：室温控制在20-24摄氏度，大鼠可自由走动并摄取标准饲料与自来水。

1.2药品

宁脑汤组成：（代赭石30g，钩藤25g，石决明25g，全蝎6g，夏枯草30g，天竺黄9g，胆南星9g，炒山栀9g，黄芩9g，怀牛膝30g，大黄粉分冲2g，三七粉分冲2g）；20%甘露醇250ml（石家庄四药有限公司，国药准字H1302303），速尿（产品批号0705142）。

1.3仪器和试剂

动物立体定性仪（江湾I型C）；202-AS型电热恒温干燥箱（北京市光明医疗仪器厂）；电子分析天平（量制京字00000249号，北京赛多利斯天平有限公司）；DEM-Ⅲ型自动酶标洗板机（北京拓普分析仪器有限责任公司）；电热恒温三用水箱（北京市光明医疗仪器厂）；全自动酶免分析仪FAME；TGL-16C台式高速离心机（金坛市医疗仪器厂制造）；OLYMPOSCH20双目显微镜；MDF-382E低温冰箱;LEICARM2135石蜡切片机;HI1210LEICA摊片机;NSE购自美国ADL公司。

2.方法

2.1动物分组给药

将实验wistar大鼠随机分为5组,宁脑汤组，西药组，中西药结合组，空白对照组和假手术组,每组约12只。给药方式：灌胃和静脉给药。各组给予药物：宁脑汤组予以宁脑汤混悬液（1.75ml/100g），西药组给予甘露醇和速尿，中西医结合组给予宁脑汤混悬液（1.75ml/100g）及甘露醇和速尿，空白对照组给予等容量蒸馏水。所有大鼠连续给药3天，每日1次，末次给药后断头取脑，分别按照各组的不同要求进行相应处理。

2.2动物模型的制备

采用立体定向技术注入自体血制作的大鼠脑出血模型。动物手术方法，参考YANG及Xue的方法，具体治法如下：

大鼠称重后以10%水合氯醛腹腔麻醉（35mg/kg体重），颅顶部皮肤脱毛，将麻醉后大鼠俯卧位固定于立体定向仪上。固定大鼠时，先固定耳间线，待听到水平针穿破耳鼓膜的破裂声后，移头部至正中，接着固定门齿于门齿沟上，调整立体定向仪，使门齿沟平面比耳间线平面低2.4mm，此时前后囟基本上在同一平面上。头部正中皮肤切开长约1cm的纵切口，血管钳钝性分离暴露前囟，调整立体定向仪，使其上的微量注射仪套管尖端移至前囟前0.5cm左侧中线旁开3cm，用微型电钻钻孔，穿透颅骨但不伤及脑组织。在大鼠尾巴末端约5mm处剪断鼠尾，用微量注射仪吸取新鲜血液约50μl，迅速插入已钻好的孔内，向内进针6mm（相当于尾状核部位）。在2.5分钟内注入，留针5分钟。拔针后无血液自针道返流，麻醉苏醒后出现神经功能缺损症状视为造模成功。

2.3样本处理

第三天末对各组模型分别予过量10%水合氯醛腹腔麻醉后取材备检.剖腹行腹主动脉取血2ml,注入真空采血管中,混匀,4-8℃放置15分钟,4℃3500转/分离心5分钟,分离血浆,-75℃冷冻保存备用。迅速断头开颅取脑组织,生理盐水轻轻洗净血污后,观察鼠血肿大小以及血肿吸收情况.取出的脑组织用10%甲醛固定24小时,常规梯度乙醇脱水,石蜡包埋,LEICARM2135石蜡切片机进行连续矢状切片(重点为出血中心区和血肿周围组织),片厚5-10μm,每个脑组织切片2张,HE染色后OLYMPUSCH20双目显微镜下观察血肿中心区,周围区,神经细胞的层次,排列情况和血肿吸收情况,并摄像。

2.4观察指标

2.4.1神经症状:参照Bederson等的标准制定[2]：

Ⅰ级，无明显障碍；

Ⅱ级，提起鼠尾使鼠头下垂位，患侧前肢回收屈曲于胸前，正常侧的前肢伸展；

Ⅲ级，追尾；

Ⅳ级，追尾且偏瘫侧腿长拖，眼分泌物多，睑模糊；

Ⅴ级，站立不稳，倒向健侧不能立起。

2.4.2组织形态学观察

光学显微镜下观察血肿中心区,周围区神经细胞的层次,排列情况和血肿吸收过程。

2.4.3血清NSE含量测定

采用酶联免疫反应法(ELISA)测定,严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.5统计学方法

均采用SPSS13.0统计软件进行分析,各组神经功能缺损症状的比较用Ridit分析。其他指标的各组实验数据用均数加减标准差（x-±s）表示，采用完全随机设计多组间方差分析。以P〈0.05认为差异具有统计学意义。

3.结果

3.1急性脑出血大鼠死亡情况

表1大鼠术后死亡情况

空白组死亡率最高,宁脑汤组同西药组比较,死亡情况无统计学差异,但中西医结合组死亡率低于单独用药组。

3.2脑出血后脑组织光镜下的组织形态学病理变化

假手术组无血肿且脑组织结构正常.空白组:低倍镜(×10)下均可见到大片出血,高倍镜下(×40)可见血肿中变性红细胞,血肿有所吸收,吞噬细胞侵润,有少量的胶质细胞增生,血肿周围区神经严重肿胀,细胞层次不清,排列松散,细胞结构不完整;中西医结合组:血肿局限,吞噬细胞侵润较其它组明显,血肿周围神经细胞也可见水肿,但细胞层次较清楚,排列较紧密,细胞结构较完整。

3.3偏瘫状态的观察

表2脑出血大鼠神经功能行为学的观察

空白组与假手术组比P<0.01，结合Ridit值，神经症状以空白组最高，宁脑汤组和西药组次之，中西医结合组更低，假手术组最低。

3.4NSE含量的变化

表3脑出血大鼠脑组织NSE含量（x-±s）

与空白对照组相比﹡，p<0.01；与中西医结合组▲相比，p<0.01

4.讨论

脑出血发病率占脑血管病发病率的12%-15%,但是它的病死率却高居首位。脑水肿是脑出血高病死率的主要因素之一。脑出血早期血肿扩大临床并非少见,近年有关临床报道较多,国内诸晓凡报道早期血肿扩大发生率高达52%[3],国外报道占38%,早期血肿扩大多发生在发病24小时内已成共识[5]。目前,对于出血性中风西医早期应用脱水剂,尤其是甘露醇是否能引起血肿扩大的研究结果不一,有研究报道发病24小时内应用甘露醇与早期血肿扩大有关[6],还有研究报道甘露醇可能在诱发血肿扩大的同时,增加了致死率。

宁脑汤是导师刘远新教授以中医理论为基础，结合多年的临床经验，形成了“降﹑清﹑化”的思路与方法，认为出血性中风的病机是：肝阳暴涨，阳化风动，气血并逆，上犯于脑，充破脑络，血溢清窍，瘀血、痰浊互结，壅阻脑髓，如挟火，火借风势，风助火威，痰热瘀阻，风火内闭而致阳闭之证，或无火热之邪，而挟痰湿壅盛，上蒙清窍，阻滞阳气而为阴闭之侯[4]。认为出血性中风患者的病情发展与转归，关键在于肝阳暴涨，气血并逆的上犯势态及脑络破损的部位，血溢量之多少。因此，治疗应从这方面立法入手，治则首先应（平肝或育阴）潜阳熄风，引血下行，挟火者泻火，兼痰者涤痰，待肝平风熄，血随气降而血宁，则出血自止，虽不止血而收止血之功。免使离经之血凝固及痰浊积阻颅内脑髓，则以祛痰化瘀等法治之，并着重调整肺、肝、肾三脏之功能，使病情转机[4]。创立了体现降、清、化法之宁脑汤，在发病超早期和早期阶段快速镇降，截断上逆之气血，阻止病情进一步演变，减轻脑水肿，稳定颅内压从而降低病死率及致残率。宁脑汤在中风发病早期快速镇降上逆之气血，引气血下行，熄风，清化痰瘀，减轻脑出血，脑水肿，减轻颅内高压对神经细胞的损害。综观全方，清上引下，快速镇降暴涨之肝阳，上逆之气血，引气血下行，熄风，清化痰瘀。全方一借通降阳明胃腑之势，赖中州枢机通降之机，直折肝阳之暴逆；二借大黄，牛膝之力上病下取，引气血下行，以缓解在上之“血菀”气血得降[7]，痰热消散，元神之府自然清净；三借大黄，三七泻下之力，去瘀化痰，使暴涨之瘀血，痰浊，有其出路，使脑水肿得以纠正，共奏“降﹑清﹑化”之功。《药鉴》：“大黄，其用走而不守，有推陈致新之功。”《医学衷中参西录》：“大黄…破一切瘀血”[8]。

烯醇化酶是糖酵解途径中的关键酶，广泛存在于生物体内，参与体内糖酵解代谢，烯醇化酶由α，β，γ三种亚基组成，现已发现五种类型的烯醇化酶同工酶(αα，ββ，γγ，αβ，αγ型)。免疫组化研究显示，烯醇化酶同工酶均存在于细胞浆中,其中γγ型特异性地存在于神经元与神经内分泌细胞中，故称为NSE。NSE含量约占脑全部可溶性蛋白的1.5%,周围神经NSE含量远低于脑内，两者相差10-100倍。当缺血，缺氧，中毒或损伤时，脑组织细胞膜的完整性受到破坏，NSE便从细胞内释放出来，进入血液循环中。NSE是反映脑损伤最灵敏且意义较大的生化指标[7]。国内外临床研究显示,脑卒中和脑外伤患者急性期血清NSE水平明显升高，脑卒中后24小时内NSE开始升高，48、72小时达高峰,且与脑出血量及脑梗死容积明显相关，NSE水平可反映脑卒中患者病情的严重程度及其预后，与脑损伤严重程度密切相关。

本实验证明中西医结合组与宁脑汤组，西药组及空白组比较,不仅死亡率降低，偏瘫状态改善等有统计学意义(P<0.01)，且可降低脑出血大鼠血清NSE含量(P<0.01)，说明它具有神经保护作用及很好的治疗作用，可减轻急性期组织损伤，减轻脑水肿，改善预后，既能弥补中药起效缓慢的缺点，又能纠正西药维持时间短的弱点，且对脏器的毒性损害可因西药用量减少而下降。故中医在中风病的防治方面显示出独特的学术优势。

参考文献

[1]HenettSA，TenniswoodM，ChenJH，etal.Chroniccerebralhyppoperfusionelicitsneuronalapoptosisandbehavioralimparement[J].Neuroreport，1998，9（1）：161-166.

[2]BedersonJB，PittsLH，TsujM，etal.Ratmiddlecerebralarteryocclusion：evaluationofthemodelanddevelopmentofaneurologicexamination[J].Stroke，1986，17：472-476.

[3]尹延河，李秀芹等.甘露醇对自发性脑出血患者继续出血的影响.临床神经病学杂志，2002，15（3）：175-176.

[4]刘远新.出血性中风之我见.新疆中医药,2001,19.

[5]秦毅.中风从痰论治体会.河北中医,2001,23（6）:442-443.

[6]温水涛，石义亭等.甘露醇对脑出血早期血肿扩大影响的动物实验研究.卒中与神经疾病，2006，13（1）30-33.

[7]WoertgenC，RothoerlRD，BrawanskiA.Neuron-specificenolaseserumlevelsaftercontrolledcorticalimpactinjuryintherat[J].JNeurotrauma，2001，18（5）：569-573.

[8]黄河清，李希等.肺血合剂治疗咯血急症临床研究.中国中西医结合急救杂志，2002，9（4）：210-212.