肺癌循环肿瘤细胞的单细胞EGFR基因突变检测

肺癌循环肿瘤细胞的单细胞EGFR基因突变检测

谢常平

谢常平（钦州市第二人民医院535099）

摘要：循环肿瘤细胞（circulatingtumorcell，）简称CTC，通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞。1869年，澳大利亚籍医生Ashworth首次提出循环肿瘤细胞的概念。1976年Nowell将CTC的定义修正为：来源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管的肿瘤细胞。目前CTC是指存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。大量研究表明，CTC以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团（CTM，CirculatingTumorMicroemboli）。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转变（EMT，EpithelialMesenchymalTransition），故CTC存在不同类型，包括上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮细胞与间质细胞混合表型。CTM和间质细胞表型CTC具有更强的转移潜能。

关键词：肺癌；循环肿瘤细胞；EGFR基因突变

恶性肿瘤都会通过血液传播转移到身体的其他器官，而肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤细胞侵入到原发肿瘤细胞的周围组织中，进入血液和淋巴管系统，形成循环肿瘤细胞CTC，并转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶[1]。因此早期发现血液中的CTC，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。新兴的循环肿瘤细胞检测技术，已成为研究热点并进入临床应用。

一、肺癌

近年来，肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，随着我国老龄人口的增加，城乡工业化进程加快，以及环境污染的加剧，肺癌的发病率和死亡率都将会持续上升。肺癌已成为我国发病率增幅最大的癌症之一，而且在相当长的时间内，它将稳居癌症死亡原因之首位。因此肺癌的预防和早期发现将成为我国肿瘤控制的重点之一。男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。已有的研究证明：长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10～20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围人群的健康产生不良影响，导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。

二、肺癌循环肿瘤细胞的单细胞

肺癌是危害人类健康与生命的主要恶性肿瘤之一。转移和复发是肺癌患者死亡的主要原因。早期诊断及监测复发和转移，对提高肺癌患者生存率尤为重要。循环肿瘤细胞作为一种新型实时监测的非侵入性诊断工具，可被看作液体活检样本，为肺癌早期预测转移、评估预后以及监测复发开辟了一个新的研究领域[2]。癌细胞在肺癌早期已有微转移发生，肿瘤细胞进人血液循环是肿瘤发生远处转移的关键步骤之一。检测循环肿瘤细胞的方法，如聚合酶链反应、免疫磁珠技术、流式细胞术、细胞自动检测系统已有较快发展。循环肿瘤细胞的检测将影响肺癌的临床分期和治疗。

三、肺癌的临床表现

肺癌在早期并没有什么特殊症状，仅为一般呼吸系统疾病所共有的症状，如咳嗽、咳痰、痰中带血、同时伴有低热、胸痛、气闷等症状，当肺癌晚期的时候，会出现面、颈部水肿，以及声嘶，气促等表现。而广泛转移肺癌的症状还可以产生持续性头痛、视力模糊，继续发展还可能会导致患者出现意识障碍的症状。

四、肺癌的临床治疗

1．临床治疗方针：治疗肺癌的前提是一定要明确肺癌病理类型及分期，对患者整体状态进行全面评估，再选择合适的方法积极治疗，改善症状，延长患者的生存期。2．手术治疗：外科治疗是肺癌首选和最主要的治疗方法。主要适合于早中期（Ⅰ～Ⅱ期）肺癌、Ⅲa期肺癌和肿瘤局限在一侧胸腔的部分选择性的Ⅲb期肺癌。3．手术切除的原则为：彻底切除原发灶和胸腔内有可能转移的淋巴结，且尽可能保留正常的肺组织，全肺切除术宜慎重。4．预后情况：早期肺癌可通过手术治愈，进展期肿瘤可同步放化疗，晚期肺癌主要以减轻症状，延长生存为主。5．放化疗的类型：（1）化学治疗：化疗是肺癌的主要治疗方法，90%以上的肺癌需要接受化疗治疗[3]。化疗对小细胞肺癌的疗效无论早期或晚期均较肯定，甚至有约1%的早期小细胞肺癌通过化疗治愈。化疗也是治疗非小细胞肺癌的主要手段，化疗治疗非小细胞肺癌的肿瘤缓解率为40%～50%。化疗一般不能治愈非小细胞肺癌，只能延长患者生存和改善生活质量。（2）放射治疗：放疗对小细胞肺癌疗效最佳，鳞状细胞癌次之，腺癌最差。肺癌放疗照射野应包括原发灶、淋巴结转移的纵膈区。同时要辅以药物治疗。鳞状细胞癌对射线有中等度的敏感性，病变以局部侵犯为主，转移相对较慢，故多用根治治疗。腺癌对射线敏感性差，且容易血道转移，故较少采用单纯放射治疗。放疗是一种局部治疗，常常需要联合化疗。6．肺癌治疗的预后：早发现、早诊断、早治疗是提高治愈率的关键。

五、EGFR基因突变检测

表皮生长因子受体（EGFR）属于酪氨酸激酶受体，它介导的信号转导途径调节细胞的生长、增殖和分化。在癌症中发现EGFR酪氨酸激酶区常发生各种突变，这些突变和酪氨酸激酶抑制剂的疗效密切相关。因此，EGFR突变的检测对癌症的个体化治疗具有重要的参考价值。EGFR已成为近年来肿瘤治疗研究和抗肿瘤药物筛选的热点，有关EGFR突变与肿瘤发生以及EGFR突变在分子靶向治疗中的作用日益受到人们的关注。EGFR突变是癌症患者是否对TKI敏感的强预测因子，因此EGFR基因突变的检测能为肿瘤靶向治疗提供依据。

从临床上对于对NCI-H1975、NCI-H1650、A549这三种非小细胞的EGFR基因突变检测实验来看，混合10%高品质胎牛情培养液以及90%RPMI-1640培养基后的三项细胞的检测结果不尽相同。具体的检测步骤为，利用集成式微流控制系统对血液里的循环肿瘤细胞进行高效的分离，从而实现捕获或释放循环肿瘤细胞的目的。此外，为有利于显微镜操作，更好地观察单个循环肿瘤细胞的情况，使单细胞基因组扩增试剂盒能够符合检测要求，克将其设计成为带有3200个微孔的微阵列芯片。在完成细胞基因组的过大工作后，利用PrimerPremier5.0软件，对相关的EGFR基因的四个外显子的检测结果进行对比和分析。

相关的临床实验结果显示，A549样本数据中并没有EGFR的基因突变现象。而与A549样本数据进行对比后发现，NCI-H1650细胞系的样本数据中携带有EGFR基因的19号外显子出现缺失，NCI-H1975细胞系的样本数据中携带有EGFR基因的20号和21号外显子出现突变。

六、结语

近年来针对EGFR为分子靶点的癌症治疗的地位越来越受到国内外的重视。其中以gefitinib和erlotinib为代表的EGFR-TKI取得一定的疗效最为突出。许多研究发现EGFR基因突变与TKI的疗效密切相关。2004年Paez等人和Lynch等人首先报道了酪氨酸激酶抑制剂对EGFR发生激活突变的患者具有显著的疗效，且女性、非吸烟者、腺癌患者、亚洲人更容易发生EGFR激活突变。有研究表明，EGFR发生突变的患者中，大约有75%对TKI治疗有反应。医学界普遍认为这两处热点突变增强了肿瘤细胞对小分子酪氨酸激酶抑制剂的敏感性并且被认为是TKI治疗的。因此，EGFR基因突变检测对于肺癌的治疗起到了重要作用。

参考文献

[1]阴建，尹寒露，王毅，等.循环肿瘤细胞的磁分离法建立及在肺癌EGFR-TKI治疗中的应用[J].临床检验杂志，2015，33（3）：170-171.

[2]王洁，张秋怡.循环肿瘤细胞分离及外周血EGFR检测的相关研究分析[J].循证医学，2016，16（1）：46-47.

[3]何文杰，江波，金从国，等.老年晚期非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞与EGFR-TKI疗效的相关性研究[J].重庆医学，2016，45（32）：4507-4508.