Westernblot检测白血病细胞的凋亡

Westernblot检测白血病细胞的凋亡

张艳君1李炳杰2

张艳君1李炳杰2

（1大庆市委党校卫生所黑龙江大庆163000；2大庆市第二医院黑龙江大庆163008）

【摘要】目的探讨Westenblot即蛋白免疫印迹法检测慢性粒细胞白血病（CML）细胞系K562细胞经过物理及化学因素（饥饿和伊马替尼）处理后，出现凋亡现象。方法应用Westernblot技术、细胞培养、蛋白质提取和定量以及凋亡的始动及执行因子Caspase-3(全长和活化)作为一抗体，羊抗兔辣根过氧物酶偶联IgG(H&L)作为二抗来检测CML细胞系K562细胞凋亡情况。结果应用Westernblot检测肿瘤细胞即K562细胞出现凋亡同时Caspase-3有高表达。

【关键词】WesternblotK562细胞凋亡Caspase-3

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）17-0246-01

K562胞是慢细性粒细胞白血病细胞（CML）系，90%的CML患者染色体异位t（9，22）导致染色体病变[1]，基因突变形成活性失控酪氨酸激酶BCR-ABL融合基因，该基因表达P210蛋白促发一系列信号转导通路，从而导致CML的发生。K562细胞是属于悬浮细胞，跟大多数肿瘤细胞相似，生长增殖很快。Westernblot又称蛋白免疫印迹，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。Westernblot常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析[2]。Caspase特异性蛋白酶是一组与细胞因子成熟和细胞凋亡有关的蛋白酶，从1992年人类第一次纯化Caspase-1克隆并测序其DNA[3]。目前已发现的哺乳动物的caspase酶共有14种，其中Caspase-3在传递细胞凋亡过程中是被激活的关键激酶，它是传递细胞凋亡信号的主要效应因子[4]。并可水解各种细胞成分而使细胞出现凋亡[5]在本研究中，我们应用伊马替尼诱导k562细胞凋亡，伊马替尼是CML治疗的一次革命变革[6]运用上述方法探究K562细胞出现凋亡的机制，从而达到治疗慢性粒细胞白血病分子靶向治疗的新靶点。

1.材料与方法

1.1细胞培养及伊马替尼药物处理

材料RPM1640培养液及检测凋亡的caspase-3全长及活化一抗、actin抗体，羊抗兔IgG二抗。

K562细胞用含10%胎牛血清RPM1640培养基培养。

1.2蛋白的提取及Westernblot

伊马替尼处理24小时和48小时后用NETP裂解细胞，超声破碎后离心，上清收集后提总蛋白，沉淀用0.1mol/L的盐酸沉淀物中再超生破碎，离心后提取组蛋白。本研究应用总蛋白样品进行Westernblot实验：第一步做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，本实验分别配10%和15%的胶，是待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。其中Marker上样量5ul,每个总蛋白样品也依次上样5-10ul，电压100v一般1.5小时左右。第二步把凝胶中分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用PVDF膜，转移的方法用电泳转移，电压85v、电流300mA转3个小时后的凝胶进行染色，几乎凝胶上没有剩余蛋白条带，转以后的PVDF膜用含5%脱脂奶粉封闭1个小时。最后一步是特异性抗体检测出已印迹在膜上所要研究的相应抗原。本实验使用Caspase-3活化和全长及actin作为特异性的第一抗体杂交结合后，放入摇床4度冰箱过夜，再用酶标的第二抗体（HRP）标记的第一抗体的抗体杂交结合，用羊抗兔二抗室温孵育1个小时，再加酶的底物ECL发光液显色进行X光底片上曝光的条带来显示抗原的存在。

1.3电子显微镜的形态学观察

我们培养的k562细胞在用伊马替尼(IM)处理24小时和48小时之前都用含0.1%FBS的RPM1640饥饿24小时，按上述剂量加的伊马替尼后，经过24小时和48小时后在倒置显微镜下观察如下结果：随着伊马替尼处理天数的增加，k562细胞凋亡明显增高；以及随着伊马替尼浓度增大，k562细胞凋亡明显增强。上述形态学观察结果表明k562细胞凋亡是与伊马替（IM）尼表现出时间和浓度依赖方式的。

2.结果与讨论

大量的研究表明，caspase-3的活化是细胞发生凋亡的标志之一。Caspase-3激活后通过其下游分子CAD(caspase激活的DNA酶)调解染色质凝聚。要确定caspase-3在伊马替尼诱导凋亡过程的功能，首先研究caspase-3是否被激活。为了说明caspase-3在伊马替尼诱导凋亡过程中的功能，首先研究caspase-3可以被伊马替尼激活[8]。K562细胞经过伊马替尼不同浓度处理24小时和48小时后，分别提取总蛋白，K562细胞经过伊马替尼作用后，提取细胞的总蛋白进行westernblot分析。结果表明，caspase-3在伊马替尼处理24小时和48小时表现caspase-3被激活程度增加，另外随着伊马替尼浓度的提高也有caspase-3被激活提高。全长的caspase-3不受影响，该实验结果表明伊马替尼诱导caspase-3的激活是时间与浓度依赖方式的。本课题从以上几种方法，尤其是westernblot研究了k562细胞出现凋亡时的确切检测结果，虽然我们同时还应用其它许多检测凋亡或磷酸化的抗体，有的得出了预期的结果，有些正在检测之中，有望在不远将来公之于众。本研究得出结论：caspase-3在凋亡过程中的确起着重要作用，通过本研究我们要研制出类似caspase-3的药物使更多的慢性粒细胞白血病得到根治。

参考文献

[1]王宇军，郭晓等BCR/ABLmRNA融合融合转录本水平与慢性粒细胞白血病演变关系检验医学与临床2008年3月第5卷第6期.

[2]网上下载WesternBlotting全攻略.

[3]熊世勤、丰锡华，Caspase激活与调控分子机制[J].生物化学与生物物理进展2002，27（10）：33-36.

[4]WatanabeM,kitanoT,etal.IncreaseofnuclearceramidethroughCaspase-3dependentregulationofthesphingomyelincycleinFas-inducedapoptosis[J].CancerRes,2004,64(3):1000-1007.

[5]龙慧、李景和TGF-B与Caspase在肿瘤细胞凋亡中的作用现代生物学进展2009vol.9No.13.

[6]NVenepalli,KRezvanietalRoleofallo-ScTforCMLin2010BoneMarrowTransplantation(2010)45,1579-1586.

[7]LuC,zhuF,ChoYY,etal.Cellapoptosis:requirementofH2AXinDNAladderformation,butnotfortheactivationofcaspase-3.MolCell,2006,23:121-132.