琼脂糖凝胶尿免疫固定电泳高蛋白尿标本稀释作用的探讨

琼脂糖凝胶尿免疫固定电泳高蛋白尿标本稀释作用的探讨

谭鸿霞黄健云吴晓枝

（中山市小榄人民医院检验科广东中山528415）

【摘要】目的：探讨高蛋白尿标本对倍稀释作用对琼脂糖凝胶尿免疫固定电泳结果准确的必要性。方法：选用临床尿常规蛋白定性≥3+或尿24小时蛋白定量≥2.0～4.0g/L的尿标本进行原液与对倍稀释后琼脂糖凝胶免疫固定电泳比较，观察两组之间的结果，扫描后记录结果并比较两种方法的清晰度。结果：经过对倍稀释后的尿标本其琼脂糖凝胶免疫固定电泳结果清晰可见，原倍标本由于浓度偏高的原因，出现明显的堆集浓染现象，而且α区带由于含量太高常常被洗脱。结论：对高蛋白尿标本进行合理的稀释后，再进行琼脂糖免疫固定电泳,是判断高蛋白尿标本结果准确可靠的必要之举。

【关键词】尿免疫固定电泳；高蛋白尿；稀释

【中图分类号】R446.12【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）33-0200-02

尿本周蛋白是诊断和监测多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）的重要标志物，同时也是多发性骨髓瘤引起肾功能损伤及疗效预后的关键指标[1]。MM是常见的一种伴有继发性肾脏病变的疾病，所致肾脏损害的发生率为60%～90%，其中50%的病例首发症状是蛋白尿或肾功不全来就诊[2]。尿本周蛋白的检测方法有热沉淀法、免疫比浊法、免疫电泳法，但这些方法的影响因素较多，其特异性和敏感性不够，检出率低。琼脂糖免疫固定电泳技术是一种利用蛋白电泳和抗原抗体相结合的一种特异性、敏感性及分辨率高的鉴别单克隆免疫球蛋白的方法，比骨髓细胞学检出更早，有利于多发性骨髓瘤的早期诊断[3]。琼脂糖免疫固定电泳是一种分子筛分离技术，样本浓度的高低对结果的准确性有重要的影响。日常工作中常遇到尿蛋白偏高的样本，这些标本由于蛋白含量太高，各区带堆积一起不能分区，且α区带由于含量太高而易被洗脱，由此给结果的判读带来极大的困惑或漏诊，给病人的诊治有可能造成损害。厂家操作说明书上有提到如何浓缩样本却没有提到对于这些高蛋白样本该如何处理，才能做出准确的结果的说明。很多MM患者早期是以顽固性肾病蛋白尿为首发症状就诊的，尿蛋白偏高（尿常规蛋白≥3+或尿24小时蛋白定量≥2.0～4.0g/L）是常见症状之一。为此，我们研究了合理稀释对高蛋白尿琼脂糖免疫固定电泳结果准确的重要性。本试验拟对20例尿本周蛋白偏高的样本，分别对其进行稀释前与稀释后的琼脂糖免疫固定电泳结果比较，探讨合理稀释对结果准确可靠的重要性。

1.材料与方法

1.1标本来源

20例高蛋白尿标本均来自我院2017年3月—2017年12月的住院病人，其中男性14例，女性6例。尿蛋白定性检测：患者空腹晨尿，利用全自动尿干化学分析仪及配套试剂进行尿蛋白的检测。24小时尿蛋白者按相关要求留取24小时尿。

1.2仪器与试剂

主要仪器与试剂（1）尿蛋白采用IrisIQ200全自动尿液分析系统及其原装配套试剂检测（尿干化学批号7204190A）；（2）24小时尿蛋白采用罗氏Cobas8000全自动生化分析仪及其原装配套试剂检测（TPUC尿液脑脊液总蛋白检测试剂，批号33644801）；（3）琼脂糖尿免疫固定电泳采用法国Se-bia公司生产的试剂盒HY-DRAGEL9BENCEJONES（批号04048/01），带抗血清免疫球蛋白（批号07028/01系列）。采用EPSONPERFECTIONV700PHOTO扫描仪来完成全套工作步骤，以获取分析所用的电泳图谱胶片。

1.3方法和步骤

尿蛋白定性≥3+或24小时蛋白定量2.0～4.0g/L判断为高蛋白尿。选20份高蛋白尿标本进行琼脂糖免疫固定电泳，步骤如下：根据实验的预先设置，把同一高蛋白尿样本进行原倍和去离子水对倍稀释后进行比对试验，其后步骤均依照操作说明进行。

（1）选择2/4BJ-UP电泳程序；（2）在ELP、GAM、κ、λ、κ-f、λ-f各齿梳孔上加10微升样本；（3）用滤纸吸去碱性缓冲琼脂糖胶片上多余的液体；（4）加200微升蒸馏水于框面下1/3处；（5）将点样板分别放于3，９位置，按启动健；（6）经过电泳后，依次加入ELP、GAM、κ、λ、κ-f、λ-f抗体；（7）将厚滤纸覆于凝胶上，吸去多余的抗血清；（8）烘干；（9）脱色－染色-显色；（10）扫描电泳图谱。

1.4结果与判读

ELP泳道相当于血清蛋白电泳，在结果判断中起对照作用，以对照标本蛋白的电泳图样。其余5个泳道各自用相应的抗血清GAM、κ、λ、κ-f、λ-f进行免疫固定：GAM泳道加入抗IgG、IgA、IgM3种免疫球蛋白重链的混合抗血清，该泳道出现克隆带即提示3种免疫球蛋白的其中1种呈克隆增生。κ和λ泳道加入抗结合型和游离型轻链的混合抗血清，标本中只要有克隆性的轻链（与重链结合或游离于血中）存在，该泳道即出现克隆条带。κ-f和λ-f泳道加入抗游离轻链抗血清，该泳道出现克隆条带提示标本中有单克隆游离轻链存在。

2.结果

对倍稀释后均获得较满意的结果。现将对比试验中的20例中的4例高蛋白尿琼脂糖凝胶尿免疫固定电泳结果扫描图谱报告如下。

图1原倍尿免疫固定电泳

图2对倍稀释后免疫固定电泳

图1标本1～4号与图2标本1～4号在凝胶片上标本与对应位置均相同。

原倍尿免疫固定电泳与对倍稀释后免疫固定电泳图像扫描可见：

（1）1、3号标本经过稀释后清晰可见，分别为λ型和K型，原倍标本由于高浓度原因，堆集浓染现象较为严重，不利于结果判断；（2）2、4号标本经过稀释后，蛋白含量比例合适，电泳图谱清晰，可报告为无反应性；（3）经过稀释后，由于蛋白比例合适，原2，3号标本高蛋白条带上被洗脱而形成的苍白区现象消失；（4）对倍稀释后κ-f和λ-f游离轻链泳道各标本均颜色较浅。

3.讨论

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法，琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，各种不同蛋白质带有不同电荷，在电场中受力大小不同，在适合的浓度中，迁移的速度不同，根据这个原理可将其分开。琼脂糖凝胶免疫固定电泳兼有“分子筛”、“电泳”“免疫分型”的三重作用。根据电泳的原理，浓度比例合适的样本才利于其迁移分离，当含量过高时各区带不能分开，且α区带由于含量太高而被洗脱。而合理稀释后再电泳则各泳道的条带清晰可见。从以上实验也发现κ-f、λ-f条带由于含量不高，一般不用进行稀释，若全部不经区别地稀释会可能将其屏蔽而漏检，κ-f、λ-f条带是判断MM的标准，所以κ-f、λ-f泳道的处理非常重要[4]。日常工作中常遇到本周蛋白偏高的样本，各区带不能分开，由此给结果的判读带来极大的困惑。厂家操作说明书上有提到如何浓缩样本，却没有提到对于这些高蛋白样本该如何处理才能做出准确的结果的说明。目前，多发性骨髓瘤有上升趋势，应该把尿本周蛋白的琼脂糖凝胶免疫固定电泳检测列入临床实验室的常规检验项目之中，同时要特别关注尿本周蛋白偏高且电泳结果染色堆集的样本，要通过合理稀释才能得出准确的实验结果。另外还要加强多学科、多领域的合作研究，对快速准确诊断、病情检测、预后判断多发性骨髓瘤等疾病有重要意义。

【参考文献】

[1]颜绵生，王松子，冯品宁，等．本周蛋白阳性的多发性骨髓瘤患者实验室检测及其临床应用探讨[J].中华临床医师杂志,2013，5（10）:4285-4286．

[2]卢新兆，袁丽萍，黄晓华，林卫,尿本周蛋白在多发性骨髓瘤诊断中的应用,医学理论与实践2016年第29卷第13期.

[3]杨璐，徐俊荣，顾兵．免疫固定电泳技术对多发性骨髓瘤的分型诊断及预后判断价值[J]．检验医学与临床,2011,16（8）:1975-1976．

[4]侯健，樊建玲.重视血清游离轻链在多发性骨髓瘤中的检测,中国实用内科杂志2008年11月第28卷第11期.