HNF4αP1与P2在胃型胃癌、肠型胃癌及肠上皮化生胃粘膜中的表达

HNF4αP1与P2在胃型胃癌、肠型胃癌及肠上皮化生胃粘膜中的表达

侯俊良1（通讯作者）张亚梅2

1湖南省马王堆医院消化内科湖南长沙410016；2中南大学湘雅医院研究生院湖南长沙410008

摘要：目的：检测肝细胞核因子4α（hepatocytenuclearfactor4α，HNF4α）P1和P2蛋白在胃型胃癌、肠型胃癌、炎性胃粘膜及肠上皮化生胃粘膜中的表达，分析HNF4αP1和P2与胃癌及胃粘膜肠上皮化生发生发展的内在联系。方法：以免疫组织化学方法检测HNF4αP1和P2蛋白在胃型胃癌、肠型胃癌、炎性胃粘膜及肠上皮化生胃粘膜中的表达及细胞内定位。结果：HNF4αP1和P2在切片组织中的表达均定位于细胞核。HNF4αP1蛋白在胃型胃癌表达显著低于肠型胃癌，炎性胃粘膜中表达显著低于肠化胃粘膜，差异均具有统计学意义（p＜0.05）。HNF4αP2蛋白在各组大部分切片中均有表达，4组两两相比均无统计学差异。结论：HNF4αP1蛋白在胃型胃癌和炎性胃粘膜中低表达，在肠型胃癌和肠化胃粘膜中高表达。HNF4αP1表达升高可能与肠型胃癌及肠上皮化生的发生相关。

关键词：胃型胃癌；肠型胃癌；HNF4α；肠上皮化生

胃癌是国际、国内最常见的恶性肿瘤之一，根据近期的统计报告，我国胃癌发病率为36.21/10万，远高于全球同期水平，位列全国人口恶性肿瘤发病率第2位，此外，我国胃癌死亡率为25.88/10万，为所有恶性肿瘤的第3位致死病因[1]。肝细胞核因子是一种转录因子，在分化成熟的肝细胞中高表达，主要在转录水平起调控作用，调节肝脏基因特异性表达，并参与调节细胞分化和代谢。近年来的研究表明HNF4α在肝细胞发育和分化中扮演重要角色，是维持肝细胞功能和生物学特征的重要转录蛋白[2-3]，参与合成白蛋白、解毒、能量代谢、胆汁酸和脂肪代谢等重要功能。HNF4α分为2类，共9种亚型，其中HNF4α1-6亚型由P1启动子调控转录，统称为HNF4αP1；HNF4α7-9亚型由P2启动子调控转录产生，统称为HNF4αP2。HNF4α参与多种恶性肿瘤发生、发展，但HNF4αP1与P2在胃癌及胃粘膜中表达的研究报道仍较少，研究结果也存在较大差异。本研究旨在检测HNF4αP1和P2蛋白在胃型胃癌、肠型胃癌、炎性胃粘膜及肠上皮化生胃粘膜中的表达，分析HNF4αP1和P2与胃癌及胃粘膜肠上皮化生发生发展的内在联系。

材料与方法

一、病例和材料

收集本医院近5年肠镜下或手术中所取胃型胃癌肿瘤组织石蜡切片30份；肠型胃癌组织石蜡切片32份；以及炎性胃粘膜组织35份，肠化胃粘膜组织31份。所有病例取组织之前未进行放疗、化疗或生物治疗，切片均经过病理学医师确认。

二、试剂和检测方法

1.试剂：过氧化氢（H2O2）：上海国药公司产品。柠檬酸、柠檬酸三钠：上海国药公司产品。DAB染色试剂盒：丹麦DAKO公司产品。苏木精：北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组织化学抗体：鼠抗人HNF4ΑP1抗体、鼠抗人HNF4ΑP2抗体（R&DSystems，Minneapolis，MN），Cy3-GoatAnti-MouseIgG、Cy3-GoatAnti-RabbitIgG和Cy3-DonkeyAnti-GoatIgG：美国sigma公司产品。辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠/兔IgG：丹麦DAKO公司产品。

2.免疫组织化学：石蜡切片3%过氧化氢（H2O2）/PBS：20分钟。1×PBS洗涤3次，每次5分钟。切片置于0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），煮沸30分钟，自然冷却。1×PBS洗涤1次。20%GoatSerum/PBS室温下封闭1小时。滴加一抗，4℃过夜。0.05%PBST洗涤3次，每次5分钟。滴加二抗，室温放置30分钟。0.05%PBST洗涤4次，每次5分钟。DAB反应：现配显色液，显微镜下观察，合适时间中止。苏木精衬染5分钟。梯度脱水、透明，中性树胶封片。

三、免疫组化结果判定

以出现棕黄色颗粒染色为阳性，计分标准：I类根据染色细胞数，小于5%计0分，5%-25%计1分，25%-50%计2分，大于50%计3分。II类根据着色强度，细胞染色阴性计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。I类及II类计分相加的总分作为判断结果，总分为0为阴性，1-2为弱阳性，3-4为中等阳性，5-6为强阳性。每张切片随机抽取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算平均得分为最终结果。

四、统计学方法

所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计，计数资料采用卡方检验，p＜0.05认为有统计学意义。

结果

HNF4αPI与P2在切片组织中的表达均定位于细胞核，呈棕黄色。30例胃型胃癌组织中有6例出现HNF4αP1蛋白的细胞核阳性表达（20.00%），27例出现HNF4αP2蛋白阳性表达（90.00%）；32例肠型胃癌组织中有24例出现HNF4αP1蛋白阳性表达（75%），28例出现HNF4αP2蛋白阳性表达（87.50%）；35例炎性胃粘膜组织中有10例出现HNF4αP1蛋白阳性表达（28.57%），33例出现HNF4αP2蛋白阳性表达（94.29%）；31例肠上皮化生胃粘膜组织中有27例出现HNF4αP1蛋白阳性表达（87.10%），29例出现HNF4αP2蛋白阳性表达（93.55%）。

HNF4αP1蛋白在胃型胃癌和炎性胃粘膜中表达阳性率较低，在肠型胃癌及肠化胃粘膜中表达阳性率较高。而HNF4αP2蛋白在4种切片中表达阳性率均相当高。胃型胃癌HNF4αP1蛋白表达显著低于肠型胃癌，差异具有统计学意义（p＜0.05）。与此类似，炎性胃粘膜中HNF4αP1蛋白表达显著低于肠化胃粘膜（p＜0.05）。然而，各组大部分切片HNF4αP2蛋白表达均为阳性，4组两两相比均无统计学差异（见表1）。

注：肠型胃癌与肠化胃粘膜中HNF4αP1及P2对比差异均无统计学意义（p值分别为0.221549478和0.41357299）。

讨论

胃癌是发病率最高的消化道肿瘤之一，严重威胁全球民众健康，初步估计我国每年大概有新发胃癌患者近40万人。胃癌的预后与胃癌的病理类型密切相关。目前认为，肠型胃癌由肠上皮化生发展而来。对胃癌不同病理类型及肠上皮化生等癌前病变的深入研究，有助于进一步了解胃癌的发生发展机制。

TanakaT的研究发现HNF4αP1主要表达于肝细胞、小肠、结肠、肾脏、附睾，HNF4αP2常见于胆管、胰腺、胃、小肠、结肠、附睾，而在胃癌、肝癌、结直肠癌中，可观察到HNF4αP1和P2表达的变化[4]。而国内关于HNF4αP1与P2在胃癌及肠化胃粘膜中表达的研究非常罕见。侯俊良以肝癌细胞株及裸鼠肝癌模型为研究对象，通过腺病毒载体导入HNF4α基因，导致HNF4α基因过表达，继而以免疫荧光、免疫组化方法检测，发现HNF4α可能通过抑制Wnt/β-Catenin信号转导通路和逆转上皮细胞间质转型过程而诱导肝癌细胞向正常肝细胞分化，从而抑制肝癌的生长[5]。NingBF等人研究DEN肝癌模型，发现肝细胞癌形成过程中，HNF4α可抑制肝细胞EMT及肝癌干细胞的产生，并有相关证据支持通过抑制NF-κB信号通路，从而抑制肝癌的进展。此外，通过皮下注射HNF4α，可以阻止裸鼠皮下种植肝癌细胞形成肿瘤组织[6]。有报道发现HNF4α在APC缺失的前提下可促进结肠肿瘤的形成，并在某些恶性肿瘤中表达上调。PiessenG等人用免疫组织化学的方法检测食管癌中HNF4α的表达，结果发现正常食管粘膜中HNF4α无表达，而在食管癌中出现HNF4α表达上调[7]。

我们的研究发现，HNF4αP1在大部分炎性胃粘膜及胃型胃癌中表达阴性，在肠化胃粘膜及肠型胃癌中绝大部分为阳性表达。表明HNF4αP1阳性表达可能为肠型胃癌发生中的早期事件，抑制HNF4αP1表达有望成为逆转肠上皮化生的全新治疗方法，并有可能抑制肠型胃癌的发生、发展。HNF4αP1表达异常与肠型胃癌及肠上皮化生的发生的内在联系，有待进一步研究。

参考文献：

[1]ZhanH，LiangH，LiuX，ecal.ExpressionofRac1，HIF-1α，andVEGFinGastricCarcinoma：CorrelationwithAngiogenesisandPrognosis.Onkologie.2013；36（3）：102-107.

[2]SuetsuguA，NagakiM，AokiH，etal.Differentiationofmousehepaticprogenitorcellsinducedbyhepatocytenuclearfactor-4andcelltransplantationinmicewithliverfibrosis.Transplantation.2008；86（9）：1178-1186.

[3]GonzalezFJ.Regulationofhepatocytenuclearfactor4alpha-mediatedtranscription.DrugMetabPharmacokinet.2008；23（1）：2-7.

[4]TanakaT，JiangS，HottaH，TakanoK，etal.DysregulatedexpressionofP1andP2promoter-drivenhepatocytenuclearfactor-4alphainthepathogenesisofhumancancer.JPathol.2006Apr；208（5）：662-72.

[5]侯俊良.肝细胞核因子4α诱导肝癌细胞分化机制研究[D].上海：第二军医大学，2009.

[6]NingBF.DingJ.YinC.ZhongW，etal.HepatocyteNuclearFactor4αSuppressestheDevelopmentofHepatocellularCarcinoma.CancerResearch2010；70（19）：7640–51.

[7]PiessenG，JonckheereN，VincentA，etal.RegulationofthehumanmucinMUC4bytaurodeoxycholicandtaurochenodeoxycholicbileacidsinoesophagealcancercellsismediatedbyhepatocytenuclearfactor1alpha.BiochemJ.2007Feb15；402（1）：81-91.