高尔基体蛋白73（GP73）在肿瘤诊断中的临床应用

高尔基体蛋白73（GP73）在肿瘤诊断中的临床应用

高社军鹿刚巨英博

高社军鹿刚巨英博（河北医科大学第四医院检验科河北石家庄050011）

【中图分类号】R730.5【文献标识码】B【文章编号】1672-5085（2012）8-0446-03

【摘要】原发性肝癌是目前世界上致死率最高的恶性肿瘤之一，在全世界范围内的发病率有逐年上升的趋势。早期诊断对肝癌患者的预后至关重要。对于肝癌的高危人群，现在最常用的监测手段是定期检测血浆中甲胎蛋白(AFP)水平和影像学检查如超声等。然而，甲胎蛋白的敏感性和特异性都不令人满意。近年来，蛋白组学技术的发展使得筛选新的肿瘤标志物成为可能，各种有希望的新的肿瘤标志物被相继发现，其中高尔基体蛋白73(GP73)最有可能成为更好的诊断肝癌，尤其是早期肝癌的血清标志物。在仅有的少数报道中，其敏感性可达69%，特异性可达90%，而其异构体敏感性和特异性可达90%和100%。除此之外，新发现的肝癌患者血清中高表达的标志物有甲胎蛋白异质体(AFP2L3)、异常凝血酶原(DCP)、α2L2岩藻糖苷酶(AFU)、磷脂酰基醇蛋白聚糖23(GPC23)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子β1(TGFβ1)、血管内皮生长因子(VEGF)、粘液素1(MUC21，KL21)等。这些新的血清标志物，正在被各种临床研究进行检测，有希望改变肝癌早期诊断和治疗的现状。我们正在进行GP73的大样本临床研究，取得初步结果。

肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)的增长速度之快已成为一个世界性难题，其发病率在全球位居第4位，总发患者数约56.4万[1]。在我国，由于乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)携带者数量之庞大，与此相关的HCC患者已占世界的55%左右，其死亡率在恶性肿瘤中排第2位。乙型肝炎、肝硬化及肝癌在医疗费用及社会负担中占有相当大的比重。在过去相当长的时间里，早期诊断HCC主要是依靠影像学手段及血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)，但影像学检查对肿瘤体积较小者不易被发现;临床上最常用的AFP也因其敏感性(39%-64%)不高并不令人满意[2]。近年来研究发现多种物质如AFP-L3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)及肿瘤生长因子β(tumorgrowthfactor-β，TGF-β)等可用于早期诊断HCC。其中高尔基体蛋白73(Golgiprotein73，GP73)被认为是最潜力的HCC血清标志物之一。现将GP73的有关进展综述如下。

1高尔基体蛋白的生物学特性

GP73是Kladney等[3]在研究成人巨细胞性肝炎(giant-cellhepatitis，GCH)病原学时首次被发现的一种相对分子质量为7.3×104Da的跨膜糖蛋白，又称为Ⅱ型高尔基体膜蛋白(Golgiphosphoprotein2，Golph2)和高尔基体膜蛋白Ⅰ(GolgimembraneproteinⅠ，GolmⅠ)。业已证实，编码GP73蛋白的基因位于第9号染色体，全长共3080个核苷酸，编码区位于199-1404nt，共编码402个氨基酸。GenBank目前已经公布了人类GP73序列共9条，其长度和核苷酸序列都有不同。已证实血浆中的可溶性GP73来源于高尔基体。其富含酸性氨基酸，氨基端为疏水末端，主要位于高尔基体内，构成跨膜区和信号肽切割位点。羧基端位于高尔基体外，包含有十四(烷)酰化连续序列(GLGNGRRS)、5个糖基化位点，一个酸性结构域及一个卷曲螺旋结构，但是到目前为止对这些结构的功能仍然不清[4]。其转录调控机可能与下列因素有关：(1)体内HBV的复制;(2)血液中雌激素及骨化三醇水平；(3)肝硬化(与病原学无关)；(4)血液中干扰素(interferin-γ，IFN-γ)和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)含量;(5)机体内弗林含量的变化；(6)急慢性肝细胞损伤等。

2GP73与肝脏疾病之间的关系

GP73在多种组织中均有表达，但强弱不等。在小肠、结肠以及胃中呈高表达，而在心脏中表达最少，在肝、肾、脾、肺、子宫及睾丸表达很弱但能检出。在正常肝脏组织，GP73主要表达于胆管上皮细胞，而在肝细胞则无表达或表达很少，但是在有HBV及腺病毒感染的肝组织中，胆管细胞表达GP73改变不明显，而肝细胞则呈高表达[5]。

2.1GP73与肝良性疾病之间的关系

GP73的表达异常与肝脏多种疾病有关。2000年Kladney等首先发现在受到病毒感染后，肝炎性多核细胞株表达GP73剧增，GP73mRNA以及其蛋白在受到腺病毒感染后的HepG2细胞中表达。而未受到感染的正常肝细胞几乎不表达。后来其进一步证实各型肝硬化组织中几乎所有肝细胞均表达，结缔组织周边和肝硬化结节尤甚。同时发现在转染了HBV并且大量复制的HepG2215细胞株中高表达GP73，而胆管细胞则无明显改变。转染了HBV但无复制和未转染HBV的Hep-G2T14。1和HepG2细胞株中均无GP73表达。后来Iftikhar等证实这一结论并发现不同的病原学(HBV相关性肝炎、HCV相关性肝炎以及自身免疫性肝炎等)导致的肝炎患者中GP73的表达没有显著性差异，随着病情的恢复，GP73表达水平也逐渐下降，GP73的水平与疾病的发展阶段有关而与其评分无关。zhou等[6]比较了由Wilson病导致的肝损害和神经损害两组患者肝组织中GP73的表达情况，结果阳性率明显不同(分别为79%和30%)并有统计学意义。同时对缺失Wilson病基因的小鼠肝组织中GP73mRNA的表达情况进行对比，发现伴随着肝炎和肝硬化的发生，其肝组织中GP73mRNA水平明显升高，但是在发生肝脏病变之前以及肝脏病变愈合之后虽然小鼠体内铜过量，其组织中GP73mRNA表达量均正常，而痊愈后的肝硬化结节中GP73仍高，由此得出在Wilson病肝细胞中GP73含量增高与铜超载无关，主要是由肝脏的炎症、纤维化及发育不良所致。

2.2GP73与HCC的关系

GP73的异常表达与肝细胞癌密切相关。Khien[7]等科研小组首先用HBV感染土拔鼠建立HCC模型，应用糖蛋白组学手段分析了患有HCC组和正常组血清中的蛋白表达差异，结果发现HCC组血清中出现一个明显增强的FcA2G2组分，进一步分析发现其代表了GP73组分，从而推测其可能是HCC的重要肿瘤标志物，并在HCC患者中的到证实。同年5月，Schwegler等应用表面增强激光吸收/电离飞行质谱(SELDI-TOF-MS)前瞻性分析了39例健康人、36例非肝硬化肝病患者、38例肝硬化患者以及57例HCC患者血清中蛋白表达差异，并根据HCV阳性与否进一步分型，结果提示肝病患者血清中蛋白表达水平与健康者明显不同，且区分慢性丙型肝炎和丙型肝炎后肝癌的敏感性和特异性分别为61%和76%，当与已知的血清标志物如AFP、DCP以及GPC3联合检测其敏感性和特异性可分别提高至75%和92%，从而推测GP73有助于肝脏良恶性疾病的鉴别。此后国外多项研究也证实HCC患者血清中GP73含量较其他疾病高且在HCC患者中，且其敏感性较AFP高[8]。国内Mao等用Westernblot方法首先研究了25例HBV携带者，24例HCC患者，12例非肝病患者及99名健康人患者血清中GP73的量，并且和血清中AFP含量进行比较，发现肝癌患者血清中的GP73水平较乙肝携带者、非肝病患者及健康人显著提高，HBV携带者、非肝病患者及健康者之间没有显著性差异。其诊断HCC的敏感性(76.9%)较AFP(48.6%)高且有统计学意义。对HCC患者进行术后随访，提示术后短期内(3-5d)GP73水平没有下降，而在术后的1.5-2年其血清中GP73水平较术前明显下降。随后Gu等进行相对较大样本试验，将29例HCC患者和其他肝病(57例乙型肝炎患者、69例肝硬化患者)及非肝脏疾病进行比较，结果提示HCC患者血清中GP73水平远较其他肝病、其他非肝脏疾病及健康志愿者高，以121μg/L作为临界值，其敏感性和特异性分别为72.4%和61.5%，提出血清GP73可能作为诊断HCC的血清肿瘤标志物。此后多项研究亦证实GP73有助于早期诊断HCC[9]。而谭龙益等[10]通过克隆、表达及纯化GP73自制多克隆抗体，建立双抗体夹心酶联免疫吸附法测定150例肝癌、120例其他肝病以及200名健康体检者血清中GP73水平,得出的结论是其诊断肝癌的敏感性和特异性分别为44.5%和82.0%，若将120例良性肝脏疾病患者加入对照组，其敏感性和特异性分别降至43.3%和77.8%，其敏感性和特异性与上述报道所有区别。同时应用免疫组化技术观察各组标本，结果也证实在正常肝组织中，胆管细胞表达GP73水平较高，而肝细胞表达水平很低。HCC患者肝组织标本中肝癌细胞表达GP73。

近年来，基因技术、蛋白质组学、肿瘤免疫等研究飞速发展，筛选出一些潜在的新的肿瘤标志物.Kladney等[11]继续深入研究，提出不管是由病毒(HBV及HCV)感染引起还是由非病毒原因(酒精性肝病及自身免疫性肝炎)引起的肝病患者中，GP73水平均显著上调。Iftikhar等[12]同样发现，在急性肝炎(包括病毒性和自身免疫性)和进行性肝硬化患者中，GP73体现出高表达。从而认为GP73的表达途径可能存在不同的机制，一种由急性肝细胞损伤触发，而另一种存在于慢性肝脏疾病进展过程中。同时，Maitra等[13]提出，GP73在急性及慢性肝脏疾病中都可以体现出高表达，提示这种蛋白对肝脏疾病的病因诊断可能并无帮助，但可以作为肝脏疾病的血清标志物。随后，Block等[14]于2005年首先提出，在肝癌患者血清中，GP73水平显著升高。在一项包括352名患者的研究中，相比较肝硬化患者，肝癌患者的血清GP73水平显著升高。如果取临界值为10个相对单位，GP73诊断肝癌的敏感性为69%，特异性为75%。对于早期肝癌(T1:单个结节，直径<2cm及T2:单个结节，直径位于2cm-5cm之间或小于三个结节，每个直径<3cm)的诊断，GP73的敏感性(62%)显著优于AFP(25%)。而且，AFP水平低于20μg/L的肝癌患者中，有57%(32/56)的人群GP73水平显著升高。从而提示，肝癌患者血清中GP73水平显著升高，且对于早期肝癌的诊断，GP73优于AFP[15]。随着蛋白组学技术的进一步发展，GP273的异质体岩藻糖基化的GP273被提出。在一项包括80名患者的研究中，GP273诊断肝癌的敏感性和特异性为65%和90%，而GP273的异质体敏感性和特异性则高达90%和100%。因此，Cassandra等提出，GP73及其异质体是肝癌可靠的肿瘤标志物。有理由认为，GP73可能成为更好的诊断肝癌尤其是早期肝癌的血清标志物。截至2007年，除了上述几项北美研究之外，亚洲地区尚无有关GP73在肝癌患者中的表达水平的临床报道，亦无与AFP等肿瘤标志物的比较研究。GP73在亚洲人群中作为肝癌早期诊断的敏感性和特异性如何?与AFP比较有无优势?与肝癌的分期和临床行为有与肝癌的分期和临床行为有无关系?肝癌患者经过手术等治疗后GP73水平是否会下降?术后患者随访过程中GP73水平的变化能否作为肿瘤复发的标志?所有这些问题均尚未有明确的答案。我们正在进行一项有关GP73的多中心、大样本的临床对照研究，正获取初步结果。

3GP73与其他恶性肿瘤的关系

GP73主要表达于上皮细胞，所以该蛋白与其他一些上皮性肿瘤密切相关。由于GP73肾脏远曲小管和集合管高表达，其在不同组织学亚型肾癌中的表达差异有统计学意义。在乳头状癌[93.7%(15/16)]和嫌色细胞癌[100%(5/5)]中高表达，而在透明细胞癌[69.9%(58/83)]中低表达甚至不表达[16]。对于前列腺癌，仅是沉积尿中的GP73对前列腺癌的诊断具有较高的敏感度和特异度(分别为75%和72%)，优于前列腺特异抗原对前列腺癌的诊断价值。但是有关前列腺癌与血清GP73水平改变的关系，国内外尚未见报道。有关胃癌细胞与高尔基体蛋白组学相关性分析国内已见报道[17]，但该项研究并未涉及到GP73。鉴于GP73在上皮性肿瘤的高表达，可以大胆设想在起源于上皮细胞的胃癌、肺癌类型中，血清GP73水平也会发生相应的改变，这仅仅是一个设想，而需要进一步的深入研究。

4结语与展望

肿瘤在蛋白组学上被认为是一组蛋白质缺陷疾病，蛋白质水平改变发生在包括肿瘤早期在内的不同阶段。该技术可以在宏观上比较肿瘤患者血清和非肿瘤患者血清的蛋白表达谱差异，为新的肿瘤标志物的发现提供有力的依据。高尔基体有多种蛋白组成，GP73仅是其中已被发现与肿瘤具有相关性的一种高尔基体跨膜蛋白，这为高尔基体蛋白组学在肿瘤中的研究拓展了新的方向。虽然GP73在分泌、运输、具体生化功能以及其在肿瘤患者血清水平改变的机制仍不明确，但是随着各界学者以及临床医师对该领域的进一步深入研究，相信以GP73为代表的高尔基体蛋白组将广泛应用到肿瘤的发病机制、早期诊断、肿瘤药物治疗靶点以及治疗效果等研究当中去。

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