牛磺酸对高糖诱导的H9c2心肌细胞的保护作用与机制

牛磺酸对高糖诱导的H9c2心肌细胞的保护作用与机制

张喆朱宁刘明琛沈丽敏马蓓洁刘莉李少春

河北大学，医学院药理教研室

摘要：目的：分析牛磺酸对高糖诱导的H9c2心肌细胞产生的保护作用以及机制。方法：将心肌细胞H9c2分为3组，①正常对照组：葡萄糖浓度为5.5mmol/L；②高糖组：葡萄糖浓度为25.5mmol/L；③牛磺酸干预组：在高糖组基础上加用40mmol/L的牛磺酸进行干预。药物干预48h后，收集细胞，检测心肌细胞凋亡发生率、丝裂原活化蛋白激酶p38MAPK的蛋白含量、TNF-α表达量、MDA及SOD水平。结果：H9c2心肌细胞的凋亡率增加，细胞TNF-α、MDA水平升高，与对照组比较（P＜0.05）；加入牛磺酸干预后，细胞凋亡率减小，SOD水平升高，与高糖组比较（P＜0.05）。结论：牛磺酸能够减轻高糖对H9c2心肌细胞的增殖抑制，对高糖诱导的H9c2细胞损伤起保护作用。

关键词：牛磺酸；高糖；心肌细胞；凋亡；氧化应激

糖尿病性心肌病是造成病人心脏微血管病变及心肌组织局部坏死的主要原因，持续高糖诱导机体氧化应激进而引起心肌细胞凋亡为DCM的发病机制之一[1，2]。牛磺酸能够通过抗氧化应激、抗炎、调节渗透压、调节离子转运等一系列的机制保护细胞[3，4]。本研究选择心肌细胞H9c2作为对象，观察牛磺酸对高糖诱导H9c2心肌细胞凋亡产生的影响。报道如下。

1材料与方法

1.1细胞复苏及培养

取H9c2细胞37℃水浴中快速融化，加入胎牛血清（10%）血清的DMEM培养基稀释，实施5min的1000rpm离心，吸弃培养基，将新鲜培养基（3mL）基重悬细胞，并吸入培养瓶，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。

1.2分组

正常对照组：H9c2细胞培养用5.5mmol/L葡萄糖浓度的正常DMEM培养基；

高糖组：完成细胞铺板后，用DMEM培养基进行24h培养，用25.5mmol/L葡萄糖终浓度的高糖DMEM培养基培养；

牛磺酸干预组：正常培养24h后，在高糖组基础上加入终浓度为40mmol/L的牛磺酸。

1.3检测细胞凋亡

细胞常规消化计数，将细胞浓度稀释为1×105/mL，于6孔板中接种，2mL/孔，置于CO2培养箱进行24h培养，吸弃培养基，换为处理后的培养基，继续培养48h。弃培养液，常规性消化，用预冷PBS重悬，4℃、进行5min的3000rpm离心，弃上清。用预冷的1×bindingbuffer重悬细胞，浓度5×105/mL。避光条件下将5μLAnnexin-V、2.5μLPI加入重悬细胞液，10min冰上孵育。加入400μL预冷的1×bindingbuffer，用流式细胞仪检测，时间＜30min。Annexin-V为绿色荧光与磷酯酰丝氨酸结合，识别早期凋亡细胞，PI可进入中晚期凋亡细胞，然后染核。3次/组，取平均值。

1.4TNF-α、MDA、SOD含量测定

心TNF-α用放免法测定，操作步骤按照说明书进行；MDA：培养细胞，弃上清，刮下细胞并转移至EP管中，按照微板法细胞中MDA测试盒说明书测定。

1.5Westernblot分析

取对数期细胞，消化计数后平铺于10cm的细胞培养皿中，分组培养，48h后用PBS对细胞冲洗，加入RIPA裂解液，刮下细胞，实施30min冰上裂解，期间间隔混匀，在4℃环境中行14000g离心15min，收集上清。用BCA法测定蛋白浓度，将几组蛋白样品调至相同浓度。配置浓度分别为10%、5%的离胶、浓缩胶，混合蛋白样品与上样缓冲液，混合液煮沸5min后点样。上样蛋白量40μg，实施SDS-PAGE电泳，浓缩胶、分离胶电压设置为60V、120V。用电转法实施2h转膜，使蛋白转至NC膜，用脱脂奶粉封闭1h，再加一抗，于4℃中孵育过夜。

1.6统计学分析

选用SPSS19.0软件进行，以（±s）表示计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，有统计学意义以P＜0.05表示。

2结果

2.1H9c2细胞凋亡率

高糖组和牛磺酸干预组心肌细胞凋亡率高于对照组，牛磺酸干预组低于高糖组（P＜0.05）。如表1、图1。

图1流式细胞仪检测各组H9c2心肌细胞凋亡情况

图2H9c2细胞中p38和p-p38蛋白表达情况比较

3讨论

DCM的病理学标志之一为心肌细胞凋亡，即心肌细胞自身发生的破坏性、程序性死亡过程。在MAPK信号家族中，p38MAPK为一个重要成员，直接参与机体细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等过程。当细胞处于氧化应激状态时，p38活化能够诱导TNF-α大量合成，TNF-α通过增加肌动蛋白和肌球蛋白重链合成，使心肌负性压力增大，导致心肌发生肥大并遭受损伤，进而诱导细胞凋亡。本研究表明，在心肌细胞凋亡率、p38磷酸化水平上，高糖组均高于对照组，证实p38在心肌细胞凋亡中的作用，同时牛磺酸干预后p38磷酸化水平下降，促进高糖诱导之后TNF-α合成得到有效减少。

SOD为机体中一个极为重要的氧自由基天然清除剂，SOD含量能够间接反映氧化应激损伤程度。若氧自由基含量过多会导致SOD活性遭受受损，导致线粒体功能紊乱发生，对细胞凋亡产生促发作用。MDA为生物体氧化反应后出现的一种产物，核酸、蛋白等大分子的相互交联均与MDA存在密切联系。本研究显示，牛磺酸可促进高糖诱导的H9c2细胞中MDA水平得到明显降低，进而促进SOD活性得到明显提高。

综上所述，牛磺酸干预可对p38MAPK通路活化产生有效抑制，促进TNF-α的表达降低，通过抑制MDA合成可促进SOD活性得到有效提高，使细胞得到有效地保护。

参考文献：

[1]YiKuang，YuanGao，JunfengShietal.Thefirstsupramolecularpeptidichydrogelatorcontainingtaurine[J].Chemicalcommunications，2014，50（21）：2772-2774.

[2]BuggerH，AbelED.Molecularmechanismsofdiabeticcardiomyopathy[J].Diabetologia，2014，57（4）：660-71.

[3]张喆，胡远想，刘伟丽，等.牛磺酸对糖尿病患者心肌保护作用的研究进展[J].山东医药，2015，55（40）：103-105.

[4]谢楠.牛磺酸对心血管系统保护作用及发生机制研究综述[J].黑龙江医药，2014，27（3）：536-539.