食品中单核细胞增生李斯特菌检测技术方法进展

食品中单核细胞增生李斯特菌检测技术方法进展

宋丽娟侯浩

宋丽娟侯浩(沈阳铁路局锦州疾病预防控制所辽宁锦州121000)

【中图分类号】R155【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）15-0112-01单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes，简称LM，以下简称单增李斯特菌），广泛存在于自然界，如土壤、污水、青饲料、食品生产加工器具、多种食品。动物和人体也带有此菌[1]，是一种重要的食源性致病菌。该菌具有很强的环境适应性，存活温度范围在-1℃～45℃，PH范围为4.0～9.5，耐盐性相当强，Nacl浓度范围为0.5%～10%，所以在食品加工、生产过程中单增李斯特菌很难被杀灭，而且单增李斯特菌在4℃仍能生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一[2][3]。单核细胞增生李斯特菌中毒严重时可引起人类的败血症、脑膜炎及单核细胞增生等多种疾病，死亡率高达35%～70%[4]，所以对实验室检验人员来说，提高单增李斯特菌的检出率具有重要的现实意义。

食品中单增李斯特菌的检测方法大致分为三类，即分离培养法、免疫学方法和分子生物学方法。

1分离培养法

是最传统的检测方法，应用国标法，即GB/4789.30—2010作为检测方法，先两次增菌，即LB1增菌液36℃±1℃培养24小时，然后再移取到LB2增菌液36℃±1℃培养18～24小时，对被检样品进行增菌，然后取LB2增菌液划线接种在科玛嘉李斯特菌显色培养基和PALCAM琼脂平板，36℃±1℃培养24～,48小时，然后经初筛鉴定等试验步骤，结果符合生化试验和溶血试验结果进行报告，但该菌革兰氏染色和镜检时要特别加以注意，因为单增李斯特菌在新鲜培养液为G+小杆菌，但在陈旧的培养液中菌体多转为G－,特别是该菌在22℃～25℃环境中能形成4根鞭毛，运动活泼，在32℃环境中仅能形成1根鞭毛，运动缓慢，在36℃培养则无动力，所以容易误判。虽然该方法实验设备要求不高，可操作性强，但检验周期长，需6～7d，这种传统的检测方法已无法满足食品生产过程中的在线检测、食品上市和消费前的快速检验要求[5]。特别是在菌浓度较少时容易漏检而呈假阴性[6]。目前，应用API（AnalyticProductsINC）进行生化试验，虽然缩短了检测时间，但由于API在反应颜色变化时，颜色深浅有一定的局限性，使其在判定结果上存在一定的主观性，而且成品较高。

2免疫学方法

免疫学检测技术主要是基于抗原和抗体反应来检测食品中的致病菌，目前已有的检查方法有：酶联免疫吸附测定（ELISA）、酶联荧光分析法（ELFA）、放射免疫法、免疫扩散等，目前，从食品中检测单增李斯特菌免疫学方法主要是ELISA技术。ELISA技术具有操作简便快速等特点，但特异性较差。

ELISA原理是基于抗原、抗体能吸附在固相载体的表面，底物经酶催化而产生有色物质，判定结果时用肉眼观察或分光光度计分析测定显色底物，从而判定被检样品中是否有相应的抗原或抗体。ELISA包括：直接ELISA，夹心ELISA和竞争ELISA。段霞等[7]应用双抗夹心ELISA方法检测食品中单增李斯特菌，可根据有色物质的颜色反应进行分析，但因ELISA技术难以进行李斯特菌种间特异分析，增加了单增李斯特菌假阳性结果的几率。随着科学技术的发展，近年来，检测单增李斯特菌多采用PCR技术。

3分子生物学方法

由于分子生物学技术的不断发展，其相关的检测方法，如PCR技术、实时荧光PCR等在单增李斯特菌的检测研究中得到了应用。

3.1传统的PCR检测方法PCR技术即聚合酶链式反应技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，已应用于感染性疾病的病原体的检测。但由于传统的PCR方法易产生假阳性，又不能准确定量等缺陷，研究者们对PCR检测技术进行了多方改进，在传统的PCR检测方法基础上，运用荧光定量PCR技术检测单增李斯特菌，实现了PCR从定性到定量的研究进展。

3.2荧光定量PCR技术荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。PCR的改进技术与传统的PCR技术相比具有明显的优势，是近年发展的新技术。该技术克服了传统的PCR技术易污染、不能定量、灵敏度不高等缺陷，同时弥补了分离培养检测周期长、检出率偏低等不足。研究表明，实时荧光定量PCR技术用于检测单增李斯特菌较传统的PCR检测具有灵敏度高、特异性强等优点。张合喜[8]等以单核细胞增生李斯特菌hlyA基因作为靶序列设计一对引物，并以单增李斯特菌标准菌株中提取的DNA作为模板，用常规PCR和荧光定量PCR对单增李斯特菌进行鉴定，含有一段特异基因的600bp片段，表现出良好的单核细胞增生性李斯特菌种特异性。结论荧光定量PCR比常规PCR特异性强，灵敏度高，重现性好，可以定量、快速地应用于检测单增李斯特菌。

徐德顺[9]等实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测单增生李斯特菌的比较结果表明，荧光定量PCR法对单增李斯特菌的检出率为12.5%，高于常规PCR法的10%及分离培养法的5%。实验表明，实时荧光定量PCR检测单增李斯特菌，从检出率、检测时间上都明显高于分离培养法和免疫学方法。

刘仲敏等[10]将单增李斯特菌实时荧光定量检测技术应用于批量样品的检测，从检样到结果判定只需2小时左右，保留了分离培养的特异性和敏感性，同步完成多个样品的扩增和定量，适宜于大批样品的检测，为食品监测提供科学依据。

4小结

单增李斯特菌是一种重要的食源性病原菌，虽然感染率较低，但死亡率较高。食品中单增李斯特菌广泛存在，对我国人民的身体健康具有潜在的危害，因此，在食品上市和消费前快速、准确地检测单增李斯特菌是我们卫生防疫部门的首要任务。

目前，国内检测单增李斯特菌主要还是采用传统的培养分离法，即国标法：以GB/4789.30—2010作为各种检测的基础，为缩短检测周期与APILISTERIA生化鉴定试剂盒联合使用，已广泛应用于微生物检测。APILISTERIA方法虽然简便、快捷，但由于生化反应结果依赖于颜色的变化，颜色在变化时有深浅之分，所以在判定结果上有一定的主观性，而且检测成本高。

免疫学方法中的ELISA，虽然简便、快速，但特异性差、灵敏度低；ELFA方法灵敏度高于ELISA，而且省去了ELISA方法中的颜色反应，缩短了整个反应时间，但缺点是成本较高，不能满足基层检测的要求。随着生物技术的发展和食品检测的需要，PCR改进技术得到了快速的发展，这些PCR改进技术与传统的PCR技术相比较具有明显的优势。所以，食品中的单增李斯特菌的检测方法应具备：简便、快速、灵敏度高、特异性强、而且检测成本低、可靠的重复性和稳定性，这已经成为众多研究者的共同期望。

参考文献

[1]朱献忠.单核细胞增生李斯特菌研究进展.中国卫生检验杂志，2007，17（7）：1333-1334.

[2]吴晓芬，程平庆.湖州市食品中单核细胞增生李斯特菌的污染状况调查[J].中国卫生检验杂志，2007，17（10）：1867-1877.

[3]戴桂勋，汤洵，张风雪等.冷藏设备污染单核细胞增生李斯特菌的分离培养方法研究[J].现代预防医学,2008,35(4):769-770.

[4]李郁，魏建中，王桂军.产单核细胞增生李斯特菌的研究进展[J].中国卫生检验杂志，2005，15（7）：888-890.

[5]寇运同，马洪明，刘晨光.用PCR技术快速检测食品中的单核细胞增生李斯特菌[J].食品科学，2001，22（5）：52-55.

[6]于兵，麻丽丹，张勇.水产品中单核细胞增生李斯特菌化学检验研究[J].食品科学，2004，25（1）：139-141.

[7]段霞，黄欣，黄岭等.双抗夹心ELISA方法检测食品中单核增生李斯特菌[J].食品科学，2010，31（24）：272-276.

[8]张合喜，饶晓红.单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测[J].新乡医学院学报，2005，22（2）：87-89.

[9]徐德顺，吴晓芳，程平庆.实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测单核增生李斯特菌的比较[J].中国卫生检验杂志，2007，17（5）：861-863.

[10]刘仲敏，郑鸣，王永芬.食源性单增李斯特菌的实时定量检测[J].食品与发酵工业，2007，（5）：100-104.