黄柏五味膏对兔骨性关节炎中滑膜炎症的防治及滑液中IL-6的影响

黄柏五味膏对兔骨性关节炎中滑膜炎症的防治及滑液中IL-6的影响

陈兵赵重熙

陈兵赵重熙（广元市中医院骨二科四川广元628000）

【中图分类号】R285.6【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)25-0093-04

【摘要】目的IL-6是最经典的炎症调节剂，是调节炎症的始动因素。本研究拟应用黄柏五味膏对兔KOA滑膜炎模型进行外敷，通过对细胞因子IL-6含量的检测，探讨黄柏五味膏通过治疗滑膜炎症从而治疗OA的可能性，并为临床进一步开发黄柏五味膏和寻找治疗OA的方法途径奠定基础。方法40只健康日本大耳白兔随机分为四组：空白组、模型组、对照组、治疗组取右膝关节为实验造模关节，采用关节内注射木瓜蛋白酶造模法造KOA并发滑膜炎模型，第3次注射完毕的第一日起开始用药干预。8周后空气栓塞法处死动物并收取右膝关节滑液，用放免（RIA）法测IL-6含量。结论实验结果提示：治疗组、对照组与模型组比较均有明显差异，从而证明黄柏五味膏可以降低关节滑液中IL-6的分泌从而达到保护关节软骨对OA起到治疗作用；而滑膜评分结果之间的显著差异性更加证明了这一点。

【关键词】骨性关节炎滑膜炎黄柏五味膏IL－6

1.实验方法

1.1实验方法

将40只兔子随机分为四组：空白组（A组）、模型组（B组）、对照组（C组）、治疗组（D组），每组10只。适应性喂养7天后，B、C、D组参照日本鬼头康彦[1]的兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节炎伴滑膜炎病变模型方法。在动物手术室内，将各造模组兔固定于手术台上，右膝关节周围皮肤均匀脱毛后，盐水冲洗。常规消毒，分别以前外侧为入路，向右膝关节腔内注入1.6%木瓜蛋白酶溶液1ml，隔3天，再注射第2次，共注射3次，注射剂量分别为1ml、1ml、1ml。于第3次注射完毕的第一日起，可认为获得稳定的骨关节炎性滑膜炎模型[2]。第3次注射完毕的第一日开始，对照组外敷扶他林软膏，厚度约2mm，均匀覆盖在伤侧关节表面，每天两次。黄柏五味膏组外敷黄柏五味膏，厚度约2mm，均匀覆盖在伤侧关节表面，每天两次。空白组和模型组外涂凡士林，厚度约2mm，均匀覆盖右侧关节表面，每天两次。

1.2标本获取

1.2.1关节滑液的收集

术后8周，每只兔腹腔注射3%戊巴比妥（30mg/kg）后，将已麻醉的兔固定于操作台上，取样部位消毒，耳缘静脉注射空气后处死。切开膝关节，用1ml生理盐水灌洗关节腔，收集关节滑液。

1.2.2关节软骨及滑膜观察

关节软骨：各组动物处死后，空白组取双侧股骨髁，余组取手术侧股骨髁，切取股骨髁内侧约4mm厚软骨标本，肉眼观察。

滑膜：用手术解剖刀精细剥取右膝前正中部分滑膜组织约0.5mg，肉眼观察。后将滑膜组织放入10%福尔马林固定24小时，石蜡包埋，6μm连续切片，作HE染色，时间5min,备组织形态学观察。

2.观察指标

2.1整体情况：精神、食欲、步态、关节有无感染、肿胀情况。

2.2肉眼观察关节软骨面、滑膜情况。

2.3光镜下滑膜组织病理学观察：HE染色、组织学分级和评分（附图1-4）。

2.4关节滑液中IL-6的含量测定：取关节滑液离心后样本，用放免法测IL-6含量。

3.统计方法

采用SPSS10.0统计软件处理实验数据，所有数据均数±标准差（x-±s）,采用方差分析和SLD-t检验进行处理。

4.实验结果

4.1一般情况

适应性喂养第二天，空白组死亡一只。造模后第一天模型组可能因创伤、麻醉反应死亡一只。A组为空白组共9只，B组为模型组共9只，C组为对照组共10只，D组为黄柏五味膏治疗组共10只。造模后所有兔子造模关节肿胀，有炎性包块形成，均有跛行，精神萎靡，食欲减退。术后3天精神、食欲逐渐恢复。

4.2大体肉眼观察关节软骨面、滑膜情况

空白组关节软骨外观呈蓝白色，半透明，色泽明亮，关节面光滑平整，无裂纹及软化，触之较硬，关节边缘规则齐整，无骨赘形成。关节液量少，质地清澈透明，滑膜颜色光亮，无增生。

模型组关节软骨失去原有光泽，发黄，色泽暗淡，软骨触之较软，股骨内髁为著，表面粗糙糜烂，欠规则，边缘有骨赘形成。关节液增多，色泽混浊，关节囊、滑膜不同程度增生、粘连、水肿，血管翳形成明显。

对照组关节软骨色泽较暗，失去原有光泽，颜色淡白。肉眼观有粗糙感，未见有明显的软骨缺损。未见关节液增多，可见滑膜增生，无骨赘形成。

治疗组软骨色泽变暗，无光泽，呈淡黄色。肉眼下透明程度和弹性下降，表面粗糙，有细小数量不多的裂隙，股骨负重面有小面积软化灶，无骨赘形成。可见滑膜有少量出血灶，关节液无明显增多。

4.3光镜下观察及滑膜评分

按Mankin’s骨关节病组织分类方法[3]对滑膜进行评分。

正常组滑膜细胞呈单层排列，较整齐，间质无水肿，滑膜下组织仅有少量毛细血管增生。HE染色示软骨层次清楚，细胞排列整齐。

模型组可见滑膜内衬层细胞增生、肥大，排列紊乱，淋巴细胞及浆细胞浸润，滑膜下组织有多处出血灶，软骨层见各层软骨细胞都有凋亡，软骨破坏严重。

对照组可见滑膜衬底细胞轻度增生，间质有水肿，伴有少量淋巴细胞和浆细胞浸润，有少量出血点。

治疗组可见滑膜上皮细胞轻度增生肥大，有少量肉芽组织，毛细血管轻度增生，有散在出血点。

注：**与正常组比较有非常显著性差异，P＜0.01；▲▲与模型组比较有非常显著性差异，P＜0.01。△△与对照组比较无明显差异，P＞0.05。

根据滑膜组织评分标准提示，模型组、对照组、治疗组和正常组比较有非常显著性差异(P<0.01)；对照组、治疗组和模型组比较有非常显著性差异(P<0.01)；治疗组和对照组比较无明显差异（P＞0.05）。

4.4关节液中IL-6含量的测定.

本实验中模型组、对照组、治疗组和正常组比较关节液中的IL-6明显升高，有非常显著性差异(P<0.01)；对照组、治疗组和模型组比较有非常显著性差异(P<0.01)；治疗组和对照组比较无明显差异（P＞0.05）。而根据滑膜组织Mankin’s评分结果显示模型组、对照组、治疗组和正常组比较有非常显著性差异(P<0.01)；对照组、治疗组和模型组比较有非常明显差异(P<0.01)；治疗组滑膜积分与对照组之间无明显差异（P＞0.05）。

5.讨论

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是以关节软骨退变及继发性骨质增生和滑膜改变为主要特征的一种慢性关节疾病[4]。

现代医学研究表明，无论是实验性OA还是人类的原发性、继发性OA，都存在轻至中度的滑膜炎症。同时我们也注意到，许多KOA患者在上下楼梯和负重时疼痛较在走行平路时加重。我们分析认为，这种疼痛是由于关节间隙变窄，滑膜受到压迫，产生炎症刺激而产生的，因为软骨没有神经分布，所以软骨损伤不会产生疼痛。软骨下骨、骨膜、滑膜、韧带和关节囊均有丰富的神经支配，这些部位的神经末稍是OA伤害性刺激的起源。当膝关节屈曲或负重时，膝关节间隙减小，此时关节腔内的滑膜受到压迫刺激而产生疼痛。所以我们初步推断：滑膜的炎性介入是加速软骨退变和诱发临床症状的重要环节。因此如何减轻、消除滑膜炎症成为治疗的关键。研究该病的病因、病理，寻找中医药防治该病的有效手段，是当前面临的课题之一。

本研究在遵循中医学理论基础上，根据笔者多年的临床工作经验，认为本病属痹病范畴，在肝脾肾三脏功能紊乱、感受外邪的基础上，逐渐形成以湿热内蕴、瘀血阻滞为代表的阴阳平衡失调、气血津液代谢障碍的病理体质。从而制定出清热解毒、活血化瘀、消肿止痛的临床经验方药黄柏五味膏，主要用于临床常见的热证、湿热证及瘀血阻滞的KOA滑膜炎患者。通过建立兔KOA滑膜炎模型，对黄柏五味膏与对照药物扶他林软膏在关节软骨、滑膜组织形态、生化代谢方面的作用进行观察，同时采用放免法（RIA）对滑膜中IL-6的含量进行检测对比，从而进一步了解本方在治疗KOA滑膜炎症方面的作用。

本方中黄柏、栀子、乳香、金银花、冰片都有抑菌作用，均可控制滑膜炎症，而且研究发现黄柏小檗碱可以抑制骨吸收,增加骨形成,对骨代谢产生一定影响,对去卵巢大鼠骨质疏松症具有防治作用。有研究发现栀子浸膏在类风湿性关节炎大鼠中可以抑制滑膜细胞的生长活性,下调致炎因子IL-1β的分泌水平。乳香可以改善微循环和血流变学；具有镇痛作用；抗炎作用。乳香在印度的传统医学中，常用于治疗各种炎症性疾病。为寻找乳香的有效成分，国内外学者对乳香的化学成分进行了较深入的研究，分离到的主要成分有五环三萜、四环三萜和大环二萜等化合物。并对这些乳香酸类成分进行了抗炎、抗肿瘤、抗氧化活性的研究及其机制的探讨[5]。金银花提取物通过抑制炎症部位炎症因子的合成或释放而发挥了类似非甾体类抗炎药物的抗炎作用。冰片在本方中主要起清热止痛的作用。常尚毅[6]等运用公英膏（蒲公英、生地、冰片）治疗膝关节创伤性滑膜炎35例，总有效率达94.3％。冰片除了消炎镇痛外还具有促进药物透过皮肤的作用。

骨内静脉瘀滞导致微循环的某些理化改变影响到滑液，滑液的改变使关节内软骨营养障碍，导致关节软骨中软骨母细胞活动紊乱，产生的软骨基质含量下降，容易导致骨关节炎。中医学中活血化瘀的方法很多,主要使用活血化瘀中药,活血化瘀中药是指具有疏通血脉、祛除瘀血而使血行通畅的药物,如本方中的栀子、乳香、冰片等,现代药理研究它们普遍具有改善血流动力学、血液流变学及微循环指标的功能，还具有明显的镇痛作用。

李健平等[7]对肿痛清软膏(由栀子、苦参、海藻、昆布等组成)进行了镇痛作用和抗炎作用的研究，证明该软膏有镇痛作用和一定的消炎作用，但对无炎症性的外刺激疼痛无明显效果。

马清钧[8]研究发现乳香一方面可以活血，另一方面还有较显著的镇痛作用,以乳香为主的子宫丸比多种抗生素有更强烈的抑菌作用,且能有效地杀灭滴虫。使用这些药物后可使血液粘滞度降低,血流顺畅,代谢废物及时清除,缺氧状态得以矫正,由骨内压升高而起的疼痛等症状减轻,这完全符合中医“痛则不通、通则不痛”的理论。我们采用外治法敷抹,此方法可由肌表透达深部,同样能起到活血化瘀、降低骨内压减轻疼痛的目的。

附图

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图18周后光镜下空白组滑膜HE染色×200

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图28周后光镜下模型组滑膜HE染色×200

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图38周后光镜下对照组滑膜HE染色×200

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图48周后光镜下黄柏五味膏组滑膜HE染色×200

参考文献

[1]KitohY，KatsuvamakiT，TanakaH，etal.EffectofSL-1010(Sodiumhyaluronatewithhighmolecularweight)onexperimentalosteoarthritisinducedbyintro-articularlyappliedpapaininrabbits[J].Foliapharmacoljapon，1992，00（5）：67～76.

[2]汪清春.骨关节炎动物模型的建立和选择[J].中医正骨，1998，10（3）：40.

[3]HenryJ,Mankin,Howarddorfman,etal.Biochemicalandmetabolicabnormal-itiesinarticularcartilagefromosteoarthritichumanhips.JboneJointSurg(Am)1971，53(3)：523.

[4]曾庆馀.症状性OA临床和流行病学探讨[J].中华内科杂志,1995，34(2)：88.

[5]郭辉，张玲.乳香中化学成分和药理作用的研究进展[J].食品与药品，2007，9(5):50.

[6]常尚毅，廖永华.公英膏治疗创伤性滑膜炎35例[J].陕西中医，1999，20(11):492.

[7]李健平，滕埠雷.肿痛清药效初试[J].长春中医学院学报，1997，13(2):56.

[8]马清钧.常用中药现代研究与临床[M]，天津:天津科技翻译出版公司,1995.386.